Sommaire
Fertilité Mâle
Male Fertility
Spermiogenèse Congélation des Spermatozoïdes Références
Historique Phases de l'eau Changements d'état Eau cristalline Phase eutectique Modification des milieux Diffusions Les solutés La viscosité Le problème cellulaire Modélisations numériques Perméabilités Perméabilité aux cryoprotecteurs Spécificité des Perméabilités Volume et surface cellulaire Géométrie cellulaire Mortalité cellulaire Salage ou effet de solution

Eau cristalline

Cristallisation de l'eau

Les formes cristallines de l'eau
Facilitation de la cristallisation
L'état de surfusion
Toute l'eau est elle cristallisable ?
L'eau adsorbée
L'eau libre et la croissance cristalline
La percolation et l'arrêt de la croissance cristalline
La fin de la congélation
Modifications des propriétés mécaniques du congelat

Formes cristallines de l'eau

Leau peut cristalliser en 5 systèmes cristallins:

  • hexagonal
  • cubique
  • rhomboédrique
  • tétragonal
  • monoclinique.
  • La transition de phase liquide / solide est modulable par la température et la pression. En phase solide, les variations de pression et de température peuvent entraîner des transitions brutales d'un type cristallin vers un autre. Pour les températures et pressions qui intéressent les biologistes, seuls les 2 premiers types sont à considérer. La transition cubique <-> hexagonale peut toutefois passer par un système tétragonal transitoire aux températures comprises entre (-10°C et 30°C).
    Les milieux intra et extra-cellulaires devraient favoriser la formation de cristaux arrondis peu agressifs. Sous 1 atmosphère, l'ajout de cryoprotecteurs permet de passer le seuil (0°C à 6°C) de formation de la glace coupante cristallisant dans le système hexagonal. Le système de cristallisation en réseaux cubiques qui intervient préférentiellement en dessous de cette température arronditles cristaux par le jeu des croissances / fontes successives qui interviennent dans la phase eutectique qui entoure les cristaux. Les cryoprotecteurs perméables jouent le même rôle dans les cellules. Dans la mesure où les milieux utilisés en congélation ne favorisent pas le type cristallin hexagonal, les seules transitions brutales entre réseaux cubiques et hexagonaux ne devraient pouvoir se produire que lors du réchauffement. Elles demandent du temps et de l'énergie. L'énergie étant disponible à la fois sous forme de chaleur, fournie pour décongeler le matériel, et sous forme mécanique, par la contraction volumique importante de la glace entre 70°C et 50°C, il est souhaitable de pratiquer des réchauffements rapides pour passer ce cap dangereux.

    Facilitation de la cristallisation

    La probabilité de former un premier cristal de glace dépend largement de la présence de motifs moléculaires (encore appelés "graines", "nucleus" ou "noyaux") de forme adéquate à la surface d'impuretés localisées dans le milieu ou à la surface du récipient [1]. De nombreuses substances végétales qualifiées "d'antigel" sont en fait des molécules qui facilitent la formation de glace à la surface des feuillages. Cette cristallisation en surface demande beaucoup d'énergie pour se produire, dégage de la chaleur latente, et retarde la formation de glace intracellulaire. Les jardiniers connaissent l'astuce qui consiste à arroser les arbres fruitiers à l'approche de la température de cristallisation. Beaucoup de ces noyaux favorisent la croissance des cristaux dans la direction de l'axe alpha du système hexagonal. Ce type de cristallisation qui forme une glace particulièrement coupante n'est pas recherché dans la congélation des cellules et organes. C'est pourquoi des cryoprotecteurs sont ajoutés aux milieux. Ils retardent la nucléation et la glace formée à plus basse température cristallise dans un système cubique moins dangereux.

    L'état de surfusion

    En absence de noyau de cristallisation, la formation du premier cristal de glace est retardée dans l'eau pure qui peut rester théoriquement en surfusion jusquà 49°C. Des températures de 45°C ont effectivement été observées dans des conditions expérimentales. La détermination de la température réelle de cristallisation de l'eau pure reste aléatoire, même dans des conditions idéalement reproductibles. Toute forme dénergie peut-être utilisée pour initialiser la cristallisation. En dessous du point de congélation, les perturbations de l'équilibre énergétique sont susceptibles de démarrer le processus. Cette propriété est utilisée dans la technique de trempe cryogénique partielle qui consiste à refroidir très rapidement une petite zone du matériel en surfusion.
    La surfusion se produit dans les dilueurs de congélation [3], mais est limitée par rapport à l'eau pure, car la quantité des noyaux de cristallisation possibles augmente avec la complexité du milieu. La cristallisation spontanée nest généralement pas recherchée aux températures > -6°C.

    Toute l'eau est elle cristallisable ?

    L'eau adsorbée

    La croissance cristalline amorcée ne concerne jamais toute l'eau liquide du milieu ou l'eau cellulaire. Dans les cellules, les couches d'eau mono-moléculaires qui sont adsorbées aux constituants biologiques ont des propriétés voisines de celle de la glace. Leurs molécules étant peu mobiles et orientées, les couches d'hydratation ont un faible pouvoir de solvatation. La capillarité, l'énergie d'adsorption et de cohésion intermoléculaire peuvent-être importantes. Leur solidification est donc probablement retardée au delà du seuil de formation de glace cristalline. Il en est probablement de même dans les espaces réduits que constituent les noyaux de spermatozoïdes où l'eau emprisonnée par capillarité entre les fibres de chromatine ne forme que rarement des cristaux visibles au niveau ultrastructural.

    Courtens, JL., Ekwall, H., Plöen, L. (1992). Comparison of nuclear hydration in boar spermatozoa before and after freeze-thawing: Contrast analysis of cells embedded in bromide-labeled medium. Microsc. Res. Tech 21:249:254. 1992
    Ekwall H Plöen L Courtens JL 1995 Embedding resin space, water contents and chromatin compaction in rabbit sperm nuclei: electron microscopic X-ray spectrophotometry of a brominated probe. Andrologia 27 175-184)

    L'eau libre et la croissance cristalline

    La croissance cristalline, dans les espaces intra ou extracellulaires où l'eau est libre, fait intervenir le transport des liquides vers les cristaux et l'augmentation de la surface de ces derniers. Beaucoup d'énergie est nécessaire à la croissance des petits cristaux très courbés. La probabilité de rencontre dune molécule convenablement orientée face à un "trou" de cette surface est également faible. La croissance est donc ralentie au début dune cristallisation progressive. Au contraire, les probabilités de rencontre deviennent plus grandes quand les cristaux développés présentent des surfaces plus planes [2] et plus grande.
    Le transport d'eau vers la surface cristallisée dépend de l'agitation moléculaire qui décroît aux basses températures. Il dépend également des possibilités de circulation de l'eau dans un milieu maillé où l'encombrement moléculaire (concentrations en solutés et en solides suspendus) augmente. Ainsi, au delà d'un seuil de percolation spécifique, l'eau ne circule plus vers les cristaux.

    La percolation et l'arrêt de la croissance cristalline

    Au fur et à mesure de la formation de glace, les liquides résiduels sont emprisonnés dans un réseau assimilable à une série de bulles reliées entre elles, et à la surface de la glace, par des micro-canaux. Pour rejoindre la surface de la glace, les liquides doivent emprunter des canaux de plus en plus ténus quand le milieu se déshydrate. Le seuil de percolation correspond à la concentration minimale du liquide encore mobilisable. Pour l'eau, ce seuil, voisin de 16%, est totalement indépendant de la géométrie et de la taille du système. La croissance cristalline s'arrête donc en deçà de ce seuil, faute de fourniture de liquide. L'eau résiduelle se solidifiera par vitrification aux températures qui ne font plus intervenir de chaleur latente, cest à dire en dessous de 102°C.

    La fin de la congélation mérite une attention particulière.

    Dans les modèles classiques, il est habituel de considérer que toute l'eau est congelée à 196°C. Ce qui est probablement exact dans un milieu minéral, mais pose le problème dune osmolarité qui tend vers l'infini en absence de précipitation. Ce problème n'est pas anodin, car les cellules retrouvent ces conditions au dégel. Dans la mesure où la décongélation est parfois plus délétère que la congélation, il est important de déterminer les propriétés du milieu qui entoure les cristaux de glace.

    Dans un milieu complexe, ou dans une émulsion, et dans l'hypothèse la plus probable d'une nucléation hétérogène, unique ou progressive, la croissance cristalline bénéficie des déplacements d'eau liquide vers la surface des cristaux. Pour que ces déplacements soient effectifs, il faut que chaque molécule d'eau soit entourée dun espace de liberté suffisant. Celui-ci diminue avec la concentration. Sa limite inférieure est définie par un indice de percolation en deçà duquel l'eau non mobilisable forme des micro-cristaux. Ceux-ci sont effectivement observés en microscopie électronique.
    La cinétique de formation de la glace est différente aux basses températures (la chaleur de fusion diminue et devient nulle en dessous de 102°C)).
    La concentration des cryoprotecteurs dans la partie non encore congelée limite la cristallisation. L'équilibre de phase entre solutés, cryoprotecteurs et eau est atteint à la température eutectique qui dépend des concentrations locales.

    La percolation en particulier montre que l'osmolarité n'est jamais supérieure à 6,25 fois la concentration avant congélation, indépendamment du milieu de départ.

    Masses de glace calculées dans une section de maxi paillette (diamètre=5mm) contenant un dilueur à base de jaune d'oeuf, de détergent (OEP) de lactose et de glycérol. Les courbes les plus basses correspondent au centre de la paillette. La simulation couvre la congélation, le stockage et le dégel.

    Modifications des propriétés mécaniques du congelat

    Le changement d'état liquide <--> solide se traduit aussi par une variation importante de volume. La masse volumique de l'eau est minimale vers 4°C et le volume de la glace continue à augmenter quand la température diminue jusquà 200°C. Le volume des cristaux néo-formés est également immédiatement plus important. Cette augmentation de volume du milieu présente des risques mécaniques (ruptures, torsions) lors des congélations.
    Les modifications de volumes cellulaires sont à considérer dans les organes et tissus quand elles deviennent suffisantes pour induire des lésions mécaniques. Ces dernières sont également provoquées par la glace extracellulaire, mais en absence de glace hexagonale, il est rare que la glace transperce les membranes cellulaires. En effet, le rayon de courbure des cristaux est plus important que le diamètre des plus petits pores membranaires connus. Sauf accident mécanique majeur (rupture de membrane), les glaces intra et extracellulaires restent normalement séparées.
    Par contre, au niveau intracellulaire, la dissection des organelles par la glace peut-être immédiatement létale, ou induire des déficits fonctionnels ou génétiques après réchauffement.

    [1] Fahy GM Levy DI and Ali SE (1987) Some emerging principle underlying the physical properties, biological actions and utility of vitrification solutions. Cryobiology 24 196-213.
    [2] Boutron P (1986) Comparison with the theory of the kinetics and extent of ice crystallization and of the glass-forming tendency in aqueous cryoprotective solutions. Cryobiology 23 88-102.
    [3] Boutron P (1984) More accurate determination of the quantity of ice crystallized at low cooling rates in the glycerol and 1,2-Propanediol aqueous solutions: comparison with the equilibrium. Cryobiology 21 183-191.


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    microscope-JLC
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    Création : JL Courtens, octobre 1997.
    Mise à jour : 20 10 2004
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