Equipe "Télomérase Lymphome Viro-Induit" 

Contexte

Epidémiologie moléculaire

Le virus de Marek est responsable de lymphomes T chez le poulet et sa distribution est mondiale. Les vaccins utilisés actuellement sont constitués de souches de MDV non-oncogènes qui protègent contre le développement des lymphomes mais n'empêchent pas la réplication des virus circulants. De plus, la présence persistante de MDV dans les élevages, son excrétion au niveau des follicules plumeux implique une exposition continuelle du personnel aviaire au virus MDV. De nombreuses études tendant à évaluer l'incidence d'une éventuelle contamination humaine ont été développées.

D'après ces études, il semble exister un excès de risque de leucémie, de maladie de Hodgkin, de lymphome non Hodgkinien et de myélome chez le personnel de la filière aviaire. De plus, une augmentation de risque de leucémie chez les éleveurs de poulets, et de myélome dans les régions à forte concentration d'élevage de volailles a été recensée. Comme une association entre hémopathie et exposition aux volailles semblait ressortir de plusieurs enquêtes épidémiologiques, en 1990 le laboratoire de Virologie et d'Oncologie Aviaire de la Station PAP (INRA-Nouzilly) a mené une enquête dirigée par F. Coudert et D. Choudat, à partir de 350 sérums de sujets issus du personnel de la filière volaille, et de 200 sérums de sujets non-exposés (personnel d'abattoir porcin et bovin, et " cols blancs ").

Cette enquête réalisée en partenariat avec la Mutualité Sociale Agricole, avait permis de mettre en évidence des anticorps dirigés contre le virus de la maladie de Marek dans les sérums des sujets issus de groupes exposés. Cependant, des fortes réactions antigéniques croisées entre le MDV et le Herpesvirus simplex (HSV1) rendaient l'interprétation difficile à cette époque. Comme il en était de même pour toutes les autres études exclusivement réalisées à l'aide de techniques d'épidémiologie, de virologie ou d'immunologie classiques, nous avons choisi de rechercher la présence d'ADN génomique de MDV chez l'homme à l'aide de techniques d'amplification moléculaire.

L'enquête a été réalisée à partir de 202 sérums humains provenant de la sérothèque établie en 1990 par F. Coudert et D. Choudat et qui comprenaient des sujets exposés professionnellement aux poulets et des individus témoins. Les premiers mois ont été consacrés à la mise au point et à l'optimisation du test de détection de MDV. Suite à cette première étude, la méthode classique d'extraction des ADN (protéinase K/phénol-chloroforme/éthanol) et la technique d'amplification par " nested-PCR " ont été retenues.

D'autre part, plusieurs essais ont été réalisés pour sélectionner la séquence cible à amplifier sur le génome de MDV. Une séquence localisée dans le gène de la glycoprotéine gD a finalement été retenue. Enfin nous avons dû mettre au point les conditions expérimentales nécessaires à la détection par test de " nested-PCR ". Parmi les 202 sérums humains testés, 51 possédaient des séquences spécifiques de MDV (25%). Tous les amplicons obtenus ont été séquencés et l'authenticité des séquences MDV a été confirmée. Les analyses ont permis de mettre en évidence 4 génogroupes différents identifiés selon 4 sites de " hot-spot " mutation. Aucune variation de prévalence n'a pu être mise en évidence en fonction de l'exposition professionnelle des sujets aux poulets, ni selon le sexe ou l'âge des sujets. (Laurent et al, 2001).

Suite à cette première étude, au moins quatre nouvelles questions se sont posées :

• quelles sont les caractéristiques des souches de MDV présentes chez les humains?
• le virus MDV est-il présent chez d'autres espèces animales?
• le virus MDV est-il impliqué dans des désordres lymphoprolifératifs humains?
• quelles sont les conditions de maintien du virus MDV chez l'homme (capacité de réplication et d'intégration)?

Oncogenèse et télomérase

La télomérase est une ribonucléoprotéine composée d'une sous-unité protéique (TERT) présentant une activité transcriptase inverse et d'une unité matricielle ARN (TR). Assurant l'élongation des télomères, elle est directement impliquée dans le maintien du patrimoine génétique au cours du cycle cellulaire. En effet, les témorères coiffent les extrémités des chromosomes les protégeant ainsi des dégradations enzymatiques, des recombinaisons et surtout des fusions interchromosomiques.

Chez les eucaryotes supérieurs, une forte activité télomérase n'est décrite que dans les cellules à fort taux de division (cellules germinales et cellules basales) ainsi que dans les lymphocytes T. Normalement absente de presque tous les autres tissus de l'organisme, toute activité télomérase dans ces derniers est pathologique et reflète l'apparition d'un processus d'immortalisation de cellules. Actuellement, une augmentation de l'activité télomérase a été décrite dans plus de 85% des cas de cancer.

Le point de départ de ce programme a été la découverte par notre équipe de la première séquence de sous-unité ARN de la télomérase (vTR) identifiée au sein d'un génome viral, dans le génome e la souche hypervirulente RB1B de MDV. Il faut noter que contrairement à ce que nous avons mis en évidence pour cette souche RB1B oncogénique, la séquence vTR n'existe pas au sein du génome de la souche MDV-HPRS24 non oncogénique. Le vTR présente une homologie de 82% avec la composante cellulaire ARN de la télomérase de poulet (cTR), et les différences entre vTR et cTR sont localisées dans des régions définies comme importantes dans la conformation des TR.

Objectifs

• Rechercher des séquences spécifiques du virus de la maladie de Marek (MDV) dans le sang de diverses espèces non aviaires (homme, bovins, porcins, ovins...) et dans des espèces aviaires autres que le poulet et la dinde.
• Analyser la variation de prévalence du MDV dans différents lymphômes humains.
• Rechercher les variations de prévalence de MDV liées au mode de nutrition humaine.
• Etudier le site et le mécanisme d'intégration du gène de MDV dans le gènome des cellules hôtes aviaires et non aviaires.
• Développer un modèle de cellules humaines lymphocytaires pour étudier in vitro l'intégration du génome MDV dans le génome hôte.
• Etudier l'assemblage de la capside virale et son rôle dans le transfert de l'ADN du MDV vers le noyau.
• Etudier la protéase MDV et caractériser son activité catalytique
• Etudier l'interaction de l'ARN télomérase viral (vTR) avec la télomérase aviaire, humaine et celle d'autres espèces animales.
• Etudier l'oncogenèse liée au virus de la maladie de Marek.
• Etudier la mécanistique du vaccin anti-tumoral anti-MDV.

• Biologie moléculaire
• Epidémiologie moléculaire
• Culture de cellules
• Techniques d'immuno-détection
• Nested-PCR
• Expression en système baculovirus

• Obtention de capsides recombinantes en système Baculovirus à partir des 4 ou 7 protéines de capside du MDV (Kut et al., 2000)
• 20 % de sujets humains sont porteurs de séquences de MDV sans variation de prévalence liée à l'exposition au poulet, au sexe et à l'âge des sujets (Laurent et al., 2001)
• Mise en évidence de la séquence du vTR (sous unité matricielle de la ribonucléoprotéine télomérase) au sein du génome MDV.

Collaborations

Contrat

Partenaires industriels

• Mérial, Réseau Cristal,

• Equipes de recherches de l'IFR Transposons et Virus (Barrière d'espèce et Cancer, Faculté de Pharmacie de Tours, resp. P. Coursaget), Microbiologie Médicale et Moléculaire, Hôpital Bretonneau Tours (resp. A. Goudeau)
• Réseaux vétérinaires, réseau Cristal
• Equipe d'Anatomopathologie de l'ENV de Nantes
• UMR-INRA Microbiologie Moléculaire de l'ENV Toulouse
• Henri-Jean Boulouis de l'ENV de Maisons-Alfort
• AFSSA Ploufragan
• Réseaux Médecine humaine
• Mutualité Sociale Agricole
• IRSA de Tours
• Equipes d'Anatomopathologie des hôpitaux de Tours et de La Roche s/Yon
• Service de Pathologie Professionnelle de l'Hôpital Cochin (resp. D. CHoudat)
• Unité INSERM U170 Recherche Epidémiologique et Statistique sur l'Environnement et la Santé (resp. J. Clavel)
• Centre National de Biotechnologie de Madrid (M. Blasco)
• Institut d'Hématopathologie de Kiel (R. Parwaresch)

Publications récentes

Laurent S., Esnault E., Dambrine G., Goudeau A., Choudat D., Rasschaert D. Detection of avian oncogenic Marek's disease herpesvirus DNA in human sera. Journal of General Virology, 2001;82:233-240.

Rasschaert D. Virus et cancers. Biofutur, 2001;(217):29-30.

Djeraba A., Kut E., Rasschaert D., Quéré P. Antiviral and antitumoral effects of recombinant chicken myelomonocytic growth factor in virally induced lymphoma. International Immunopharmacology, 2002; 2:1557-1566.

Djeraba A., Musset E., Bernardet N., Le Vern Y., Quéré P. Similar pattern of iNOS expression, NO production and cytokine response in genetic and vaccination-acquired resistance to Marek's disease. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2002;85:63-75.

Djeraba A., Musset E., Lowentha, J.W., Boyle D.B., Chaussé A.M., Péloille M., Quéré P. Protective effect of avian myelomonocytic growth factor in infection with Marek's disease virus. Journal of Virology, 2002, 76:1062-1070.

Djeraba A., Musset E., Van Rooijen N., Quéré P. Resistance and susceptibility to Marek's disease: nitric oxide synthase/arginase activity balance. Veterinary Microbiology, 2002, 86:229-244.

Laurent S., Kut E., Remy-Delaunay S., Rasschaert D. Folding of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein and delineation of N-terminal domains dispensable for assembly. Archives of Virology, 2002; 147:1559-1571.

Le Rouzic E., Thoraval P., Afanassieff M., Cherel Y., Dambrine G., Perbal B. Alterations of the MDV oncogenic regions in an MDV transformed lymphoblastoid cell line. Journal of Clinical Pathology, 2002; 55:262-272.

Douaire M., Vignal A., Duclos M.J., Dambrine G. Les outils de la génomique et leurs applications en sélection avicole. 4. Journées de la Recherche Avicole. Nantes (FRA), 27-29 mars 2001, 2001:357-364.

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Djeraba A., Musset E., Kut E., Rasschaert D., Quéré P. Antiviral effect of recombinant chicken MGF on Marek's disease virus . Annual Meeting of the International Society for Interferon and Cytokine Research. Cliveland (USA), 07-11 octobre 2001. Journal of Interferon and Cytokine Research, 2001;21:S135.

Laurent S., Esnault E., Rasschaert D. Franchissement de la barrière d'espèce par le virus de la maladie de Marek (MDV). (Atelier 4 : Barrière d'espèces) Séminaire - Dourdan. Dourdan (FRA) 09-11 mai 2001, 2001:37.

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Fragnet L., Rasschaert D. First identification of a viral RNA telomerase subunit. 12. International Congress of Virology. The World of Microbes. Paris (FRA), 27/07-01/08/2002 Poster Session : Viruses and Cancer, Poster n°V-1449, 2002 ; p.483.

Le Gall-Recule G., Zwingelstein F., Laurent S., de Boisseson C., Portejoie Y., Rasschaert D. Phylogenetic analysis of rabbit haemorrhagic disease virus (RDHV) in France during 1993 to 2000 and characterization of RHDVA antigenic variants. 12. International Congress of Virology. The World of Microbes. Paris (FRA), 27/07-01/08/2002, Poster Session : Calici- and Astrovirus, Poster n°V-698, 2002 ; p.236.