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Introduction

      Les coccidioses du lapin sont des infections parasitaires causées par des protozoaires du genre Eimeria, se développant dans l'épithélium du tube digestif. En élevage, les Eimeria causent des entéropathies parfois sévères qui altèrent les performances des animaux, notamment en terme de croissance. L'utilisation d'anticoccidiens est nécessaire au contrôle de ces maladies. En effet, certaines caractéristiques de la biologie du parasite, et en particulier son fort taux de multiplication chez son hôte, l'absence d'hôte intermédiaire, la contamination des animaux par voie orale et la grande résistance et persistance des parasites dans le milieu extérieur, rendent illusoire l'éradication par simple prophylaxie hygiénique. Cependant, l'utilisation non rationnelle du seul anticoccidien autorisé en cuniculture (Robénidine) pendant près de 20 ans a conduit à l'émergence de chimiorésistances chez certaines espèces. De plus, la pression des consommateurs est de plus en plus forte pour réduire l'emploi des substances chimiques dans l'alimentation animale. Le développement d'autres moyens prophylactiques pour lutter contre les coccidioses est donc nécessaire.

      Une des caractéristiques des Eimeria est leur très forte immunogénicité ; une infection primaire protège contre une réinfection par la même espèce. Cette caractéristique rend envisageable le développement d'une méthode d'immunoprophylaxie. Actuellement, chez le poulet, espèce pour laquelle se posent les mêmes problèmes de coccidiose en élevage, la vaccination par utilisation de parasites virulents ou atténués est efficace sur le terrain dans certains types de production. Des souches parasitaires de virulence atténuée ont également été mises au point chez le lapin et des essais préliminaires de vaccination sur le terrain ont donné des résultats prometteurs. Cependant, la dissémination de souches vivantes ainsi que le coût de production relativement important de ce type de vaccin encouragent à poursuivre les recherches sur le développement de nouvelles techniques de vaccination. Un préalable nécessaire à la mise en place d'une prophylaxie adéquate est une meilleure connaissance de la biologie du parasite et de ses interactions avec le système immunitaire de l'hôte. Si ces deux aspects sont totalement complémentaires, l'état de nos connaissances dans ces deux domaines chez le lapin est très différent.

      Les divers aspects des coccidioses, le développement endogène du parasite, la physiopathologie et les moyens prophylactiques ont été largement étudiés dans de nombreux laboratoires s'intéressant aux volailles et dans le laboratoire de Pathologie du Lapin. Cependant, parmi les travaux sur le cycle de développement, peu nombreux sont ceux qui concernent la phase précoce d'invasion de l'organisme. Ce premier contact du parasite avec son hôte est pourtant fondamental puisqu'il peut conditionner le déclenchement de la réponse immunitaire limitant l'expansion du parasite chez l'animal primo-infecté. De plus, lors de la réinfection, les mécanismes immunitaires protecteurs permettent l'arrêt du développement parasitaire dès cette phase d'invasion. Il nous a donc semblé important d'aborder de façon plus approfondie cette étape du cycle parasitaire.

      Les connaissances concernant la réponse immune chez le lapin sont particulièrement modestes et les outils et les réactifs encore peu nombreux. La plupart des travaux concernant l'immunité contre les Eimeria ont été réalisés avec le modèle de choix qu'est la souris. Nous avons donc abordé cette partie de notre étude avec l'objectif de déterminer, dans un premier temps, les moments clés de la réaction immunitaire chez le lapin et les principales cellules impliquées.

      Dans notre étude le lien entre ces deux aspects, invasion de l'organisme et nature des cellules impliquées, est d'autant plus fort que les premières cellules cibles du parasite sont des cellules lymphoïdes.


Revue bibliographique


Biologie du parasite


Taxonomie des Eimeria

      Les Eimeria sont des protozoaires parasites (Sporozoaires), intracellulaires obligatoires, appartenant au phylum des Apicomplexa (Tab 1). Les stades invasifs du parasite sont caractérisés par la présence d'un complexe apical constitué du conoïde, des rhoptries, des micronèmes et des granules denses, organites spécifiquement impliqués dans les mécanismes d'invasion de la cellule hôte. Le genre Eimeria se différencie du genre Isospora par l'organisation des oocystes : chez les Eimeria les oocystes comportent 4 sporocystes renfermant chacun 2 sporozoïtes. Les Eimeria se multiplient en majorité au niveau de l'intestin.

      Plus de 25 espèces d'Eimeria ont été décrites comme parasites du lapin. Cependant, les synonymies sont nombreuses et Levine (1973) et Pellérdy (1974) ont estimé que seule une douzaine d'espèces peut être réellement rencontrée. Actuellement, onze espèces d'Eimeria du lapin ont été identifiées et isolées par le laboratoire de Pathologie du Lapin de l'INRA de Tours (Tab2); (Coudert et al., 1995 et 2000). Plusieurs critères de diagnose sont utilisés pour la caractérisation des espèces : la morphologie de l'oocyste, la période prépatente qui correspond au temps de développement endogène du parasite (de l'ingestion des oocystes à l'excrétion des premiers oocystes) et dont la durée dépend de l'espèce, le temps de sporulation à une température donnée, le taux de multiplication, les lésions induites selon leur nature et leur localisation.

      Actuellement, Les espèces les plus fréquemment rencontrées dans les élevages cunicoles sont E. magna (Peeters et al., 1983) , E. media (Catchpole et Norton, 1979)et E. perforans. Dans les élevages traditionnels on rencontre aussi fréquemment E. flavescens et E. intestinalis.


Cycle parasitaire des Eimeria du lapin

      Les Eimeria sont des parasites monoxènes et ont une spécificité très poussée vis-à-vis de leur hôte. Le cycle biologique comprend une phase de multiplication chez l'animal et une phase de maturation et de dissémination du parasite dans le milieu extérieur

      

Fig. 1 : Cycle des Eimeria (d'après Licois).

      De nombreux travaux ont été réalisés sur le cycle de développement des coccidies chez le lapin, notamment sur E. stiedai (Rose, 1959 ; Horton, 1967 ; Pellérdy et Dürr, 1970), E. perforans (Coudert et al., 1979 ; Streun et al., 1979), E. magna (Danforth et Hammond, 1972 ; Ryley et Robinson, 1976 ; Pakandl et al., 1996a), E. vedjovskyi (Pakandl, 1988 ; Pakandl et Coudert, 1999), E. media (Pakandl, 1988 ; Pakandl et al., 1996c), E. intestinalis (Licois et al., 1992a ; Drouet-Viard et al., 1994b) et E. coecicola (Pakandl, 1989 ; Pakandl et al., 1993 et 1996b). Seule E. stiedai possède un tropisme particulier pour les canaux biliaires du foie, les autres espèces de coccidies du lapin sont à tropisme intestinal.

      L'animal se contamine en ingérant des oocystes sporulés présents dans le milieu extérieur. La paroi des oocystes est lysée dans l'estomac, les sporocystes sont ainsi libérés. L'excystation se produit dans le duodénum sous l'action des différentes enzymes pancréatiques (trypsine...) et des sels biliaires ; les sporozoïtes libérés constituent les éléments infectants et pénètrent activement dans les cellules épithéliales de ce segment. Quelques heures plus tard, ils sont observés dans les cellules épithéliales de leur site de multiplication. Le sporozoïte se transforme alors en trophozoïte et subit plusieurs phases de multiplication asexuée, appelées mérogonies, aboutissant à la formation de générations successives de mérontes. A maturité, les mérozoïtes sont libérés de la cellule hôte et vont infecter les cellules voisines. Le nombre de mérogonies est fixe pour une espèce donnée. A chaque génération 2 types de mérontes sont observés. Les mérontes de type A contiennent de gros mérozoïtes, polynucléés et peu nombreux, qui se divisent par endomérogonie. Les mérontes de type B produisent des mérozoïtes uninucléés, plus fins et plus nombreux que ceux des mérontes de type A, par un processus d'ectomérogonie ; on pense que le type A est lié à la formation des microgamètes ('lignée' mâle) alors que le type B est associé à la formation des macrogamètes ('lignée' femelle) (Streun et al., 1979 ; Licois et al., 1992a ; Pakandl et al., 1996a ; 1996b ; 1996c). Les types A et B sont équivalents en nombre au cours de la première génération mais le type B prédomine au cours des dernières mérogonies. La gamogonie constitue la phase sexuée du cycle. Les mérozoïtes de la dernière génération envahissent de nouvelles cellules intestinales et se différentient en microgamontes ou macrogamontes respectivement à l'origine des microgamètes et macrogamètes. Les microgamètes mâles mobiles et flagellés vont féconder les macrogamètes femelles intracellulaires et immobiles. Le zygote obtenu s'entoure d'une coque et forme un oocyste immature libéré de sa cellule hôte et excrété avec les fèces dans le milieu extérieur. Les oocystes ainsi dispersés vont subir une phase de maturation, la sporogonie : une série de transformations du sporonte aboutit à la formation d'oocystes sporulés infectants. Ces différentes étapes ont été décrites dans le cas d'E. stiedai. Initialement, l'oocyste renferme une cellule diploïde, le sporonte, qui va se diviser plusieurs fois -une méiose suivie de 2 mitoses- pour aboutir à la formation de 4 sporocystes contenant chacun 2 sporozoïtes (Coudert et al., 1973). Le temps de sporulation est variable selon l'espèce et dépend de la température (température optimale de 26°C), du degré d'hygrométrie et de l'oxygénation. L'oocyste est l'élément de survie dans le milieu extérieur. Il se caractérise par son extraordinaire résistance, notamment aux agents chimiques. Cette résistance n'est pas sans conséquences pratiques, en particulier dans la désinfection des locaux et du matériel d'élevage. Seules la chaleur et la dessiccation peuvent détruire efficacement les oocystes.


Caractéristiques des Eimeria du lapin

      Nous insisterons plus particulièrement sur les caractéristiques des 2 espèces d'Eimeria qui ont été utilisées dans nos études, E. coecicola et E. intestinalis.


Caractérisation morphologique des Eimeria (Eckert et al., 1995)

      Au laboratoire, l'identification des Eimeria est basée sur la morphologie des oocystes. Ceux-ci se différencient en fonction des espèces par leur taille, leur forme, l'aspect du micropyle et la présence ou non d'un corps résiduel oocystal (Fig 2).

      Eimeria coecicola a été décrite pour la première fois par Cheissin (1947). Les oocystes d'E. coecicola sont ovoïdes et allongés, ils mesurent de 27 à 40 µm de long sur 15 à 22 µm de large. Le micropyle est parfaitement visible et forme une légère protubérance. Le corps résiduel oocystal est plus petit que celui d'E. media avec laquelle il est possible de la confondre. Eimeria intestinalis a également été caractérisée par Cheissin (1948). Les oocystes d'E. intestinalis sont piriformes ou de forme losangique, ils mesurent de 25 à 30 µm de long sur 15 à 29 de large (Cheissin, 1948). Le micropyle, à la partie étroite de l'oocyste, est nettement visible et les oocystes sporulés présentent un corps résiduel de taille relativement importante ce qui les distingue des oocystes d'E. piriformis qui en sont dépourvus (Pellérdy, 1953).

      

Fig. 2 . Morphologie des oocystes des différentes espèces d'Eimeria du lapin (d'après Coudert).


Pouvoir de multiplication et excrétion d'oocystes

      Le pouvoir de multiplication et l'excrétion d'oocystes varient en fonction de l'espèce considérée. Le développement du parasite comporte plusieurs mérogonies dont le nombre est fixe pour une espèce donnée mais variable d'une espèce à l'autre (4 pour E. coecicola et E. intestinalis, 3 pour E. media).

      L'excrétion d'oocystes s'étale sur 4 à 5 jours avec un pic d'excrétion au début de la période patente. L'inoculation de forte doses d'oocystes peut conduire à un allongement de la période patente.

      Pour plusieurs espèces d'Eimeria, dont E. coecicola et E. intestinalis, l'excrétion totale d'oocystes est proportionnelle à la quantité inoculée lorsque celle-ci est faible (Coudert, 1989 ; Licois et al., 1992b). En revanche, au-delà d'un certaine quantité d'oocystes administrée (ce seuil varie en fonction des espèces), le taux d'excrétion atteint un plateau. Ainsi, pour E. coecicola, 1 seul oocyste inoculé permet l'excrétion de 3 à 8 x 105 oocystes par lapin. L'excrétion est proportionnelle jusqu'à 400 oocystes, quantité au-delà de laquelle l'excrétion maximale de 3 à 4 x 108 oocystes est obtenue (Fig 3). E. intestinalis possède un pouvoir de multiplication supérieur à E. coecicola et à toutes les autres espèces d'Eimeria du lapin : 1 oocyste inoculé permet la production de 3 à 5 x 106 oocystes, l'excrétion est dose dépendante jusqu'à la dose de 1000 oocystes inoculée, au-delà de laquelle le maximum de 3 à 5 x 109 oocystes excrétés est atteint (Fig 3).

      

Fig. 3 : Excrétion d'oocystes par lapin en fonction de la quantité d'oocystes d'E. intestinalis ou d'E coecicola inoculée.


Pouvoir pathogène et immunogène

      Les Eimeria du lapin peuvent être classées en 4 catégories en fonction de leur pouvoir pathogène : non pathogènes, peu pathogènes, moyennement pathogènes (ou pathogènes) et très pathogènes. Ce classement des différentes espèces est lié à l'importance des symptômes cliniques observés au cours de l'infection, c'est-à-dire essentiellement l'impact sur le gain de poids, la présence de diarrhées et la mortalité (Tab 3). E. coecicola est une espèce non pathogène pour laquelle aucun symptôme clinique n'est observé au cours de l'infection. Des lésions ne sont visibles qu'avec des doses d'oocystes inoculées très importantes. E. intestinalis est, en revanche, avec E. flavescens l'espèce la plus pathogène (Coudert, 1976 ; Peeters et al., 1984 ; Coudert, 1989). Elle cause des diarrhées importantes, de sévères diminutions du gain de poids et peut entraîner la mort d'un grand nombre d'animaux. Il faut remarquer que l'excrétion d'oocystes atteignant rapidement un plateau il n'y a pas de corrélation entre le taux d'excrétion d'oocystes et la sévérité de la maladie (Coudert, 1989).

      
Tab. 3 : Pouvoir pathogène comparé des différentes coccidies du lapin.
PATHOGENICITE Eimeria SYMPTOMES
Non pathogène E. coecicola Aucun signe clinique de maladie
Peu pathogène E. perforans
E. exigua
E. vejdovskyi
Légère chute de GMQ
Pas de diarrhée
Pas de mortalité
Pathogène E. media
E. magna
E. piriformis
E. irresidua
Chute de GMQ
Diarhée possible
Mortalité dépendant de la dose (plus importante à partir de 1x105 oocystes inoculés)
Très pathogène E. intestinalis
E. flavescens
Sévère chute de GMQ
Diarrhée importante
Forte mortalité (DL50=3000 à 5000 oocystes)
Pathogénicité dépendant de la dose E. stiedai Faible chute de poids dans des conditions d'élevage rationnel. Chute de poids et mortalité avec des doses expérimentales > ; 1x105
GMQ : gain de poids quotidien moyen.

      La plupart des Eimeria du lapin sont très immunogènes et l'infection primaire confère une bonne protection aux animaux. L'immunogénicité n'est pas liée au pouvoir pathogène de l'espèce. En effet, E. intestinalis qui est une espèce très pathogène est très immunogène (Licois et Coudert, 1980b ; Coudert et al., 1993) mais E. coecicola qui est une espèce non pathogène l'est également (Coudert et al., 1990 ; Licois et al., 1992b).


Physiopathologie de la coccidiose du lapin (Coudert, 1996)

      Il existe deux types de coccidioses : la coccidiose hépatique dont l'espèce responsable, E. stiedai, se développe dans les canaux biliaires du foie et la coccidiose intestinale, provoquée par une ou plusieurs des autres espèces se développant dans les différentes parties de l'intestin. En élevage, l'importance des coccidioses tient à plusieurs facteurs :

  • ces infections affectent le tube digestif et sont responsables d'un ralentissement, voire d'un arrêt de la croissance.
  • les coccidies possèdent une capacité de multiplication énorme associée à une très forte résistance des oocystes dans le milieu extérieur.
  • il n'existe pas de lapins indemnes de coccidies en dehors de certains laboratoires de recherche. Les coccidies persistent toujours chez les reproducteurs (porteurs sains).
  • le lapereau ne devient sensible à la coccidiose que 3 à 4 semaines après la naissance (Coudert et al., 1991) et il n'y a pas de transmission materno-foetale de l'immunité (Drouet-Viard et al., 1994a).

      En élevage, les coccidioses du lapin sont causées par une ou plusieurs espèces d'Eimeria.

      Expérimentalement, ces agents pathogènes spécifiques induisent une maladie très reproductible (mêmes lésions et mêmes symptômes chez 100% des animaux). Cependant, la plupart des signes cliniques ne sont pas spécifiques aux coccidioses intestinales. Le symptôme le plus fréquent est une diminution du gain de poids et de la consommation d'eau et d'aliment. Entre le 7ème et le 10ème jour de l'infection, la perte de poids peut atteindre 20% du poids vif ; cependant les animaux peuvent reprendre rapidement leur croissance initiale s'ils survivent. Les cas de diarrhées sont plus rares mais sont les premiers symptômes visibles apparaissant entre le 4ème et le 6ème jour de l'infection selon l'espèce infectante. Le nombre de cas est maximal entre le 8ème et 10ème jour. Les fèces sont simplement davantage hydratées lorsqu'il s'agit d'une infection par E. intestinalis ou E. magna mais sont liquides lorsqu'il s'agit d'une infection par E. flavescens. La mortalité, qui survient brutalement entre le 9ème et le 12ème jour après l'infection, apparaît avec une certaine constance dans les cas d'infection par E. intestinalis ou E. flavescens.

      L'ensemble des symptômes décrits dépend de l'espèce d'Eimeria considérée, du degré d'infection, de l'animal, de son état sanitaire et peut être aggravé par le développement de bactéries pathogènes opportunistes. L'évolution des différents symptômes est représentée sur la figure 4.

      

Fig. 4 : Schéma général de l'évolution clinique d'une coccidiose expérimentale (d'après Coudert).

      Comparée aux diarrhées observées chez le veau ou chez l'enfant, caractérisées par une perte considérable de matières fécales (contenant de l'eau et des minéraux, principalement du sodium), une déshydratation extracellulaire et une acidose métabolique, la diarrhée chez le lapin est atypique. Elle se traduit par une diminution de l'excrétion fécale, une absence de modification de la distribution de l'eau dans l'organisme (seule la peau se trouve fortement déshydratée) et on n'observe pas de variations du pH sanguin. La modification la plus marquée au niveau du plasma sanguin est une sévère hypokaliémie résultant d'une perte de potassium dans les fèces (Licois et al., 1978 ; Licois et Coudert, 1980a et 1980b). La modification de ces paramètres est la plus importante au moment où la gravité de la maladie est maximale, le 10ème jour qui suit l'infection. Au cours des épisodes diarrhéiques on constate également une augmentation du temps de rétention des ingesta dans l'intestin, associée à une augmentation de la flore colibacillaire et à une alcalinisation du pH intestinal.

      Les lésions observées sont de 2 types, macroscopiques et histologiques. Les lésions macroscopiques apparaissent dans l'intestin au niveau du site préférentiel de développement de l'espèce d'Eimeria considérée. Le plus souvent la partie de l'intestin infectée est oedémateuse et blanchâtre et la segmentation est nettement visible. Les lésions histologiques observées consistent en une hypertrophie des cellules épithéliales parasitées ou non. La structure cellulaire reste cependant intacte sauf lors de la libération des oocystes où les cellules éclatent et desquament (Peeters et al., 1984). Quelques îlots cellulaires peuvent également être détruits dans les cryptes de Lieberkühn. L'importance des lésions est maximale au moment de la gamogonie et dépend de l'espèce et de la dose d'oocystes inoculée. Malgré leur aspect spectaculaire, ces lésions sont fugaces et ne sont visibles que pendant 3 à 4 jours ; elle apparaissent entre le 8ème et le 9ème jour et disparaissent entre le 12ème et le 13ème jour.

      Sur le terrain, les aspects lésionnels décrits sont rarement rencontrés ; les doses infectantes sont probablement plus faibles et étalées dans le temps comparées aux infections expérimentales. De plus, les surinfections bactériennes rendent le diagnostic difficile et il n'y a pas de corrélation entre l'excrétion d'oocystes et la sévérité de la maladie (Cf § 2.3).


Prophylaxie et traitement de la coccidiose

      La coccidiose, comme de nombreuses autres pathologies du lapin, est souvent la conséquence d'agressions non spécifiques telles que le bruit, le stress, le transport... Ces agressions favorisent l'épuisement des capacités de réaction de l'organisme, créant ainsi un terrain propice au développement des coccidies. La lutte contre le parasite nécessite donc, tout d'abord, une bonne hygiène et des conditions d'élevage contrôlées (contrôle du microbisme, contrôle du bruit, alimentation, ventilation, température et taux d'humidité adéquates...). Une lutte directe contre le parasite grâce à l'utilisation d'anticoccidiens est également nécessaire. La très grande résistance des oocystes dans le milieu extérieur ne permet pas la suppression de la pression médicamenteuse.

      Actuellement, les anticoccidiens sont distribués de façon préventive dans les aliments complets. Le plus utilisé est la Robénidine. Cette molécule est très efficace et très bien tolérée par le lapin (Coudert, 1979 ; Peeters et al., 1979 ; Licois et Coudert, 1980a ; Coudert et al., 2000) ; malheureusement son usage intensif en Europe depuis 1980 a conduit à l'apparition de problèmes de chimio-résistances notamment avec E. media et E. magna (Peeters et al., 1987 et 1988 ; Coudert et al., 2000). La plupart des anticoccidiens de la famille des ionophores, utilisés en aviculture, sont toxiques chez le lapin. Néanmoins, la Salinomycine administrée à 20 ppm dans l'aliment est bien tolérée et très efficace (Peeters et al., 1988 ; Coudert, 1989) mais n'est autorisée que chez les lapins à l'engraissement et non chez les reproducteurs. Les autres traitements curatifs efficaces contre les coccidioses sont les sulfamides (sulfadiméthoxine surtout) et des molécules plus récentes comme le diclazuril et le toltrazuril.

      L'apparition progressive de chimio-résistances aux anticoccidiens et la pression des consommateurs pour diminuer l'utilisation des substances médicamenteuses chez les animaux d'élevage, incitent à développer de nouveaux moyens de lutte. La vaccination semble être une approche séduisante puisque la plupart des espèces induisent une bonne protection contre une réinfection. Actuellement, les seuls vaccins ayant montré une réelle efficacité dans la lutte contre les maladies parasitaires sont des vaccins vivants. Des souches d'Eimeria dites 'précoces', ayant un pouvoir pathogène fortement diminué, ont été obtenues chez le poulet par sélection des premiers oocystes produits au cours des inoculations successives ; elles possèdent un cycle raccourci et présentent une capacité de multiplication réduite (Jeffers, 1975 ; McDonald et al., 1982 ; McDonald et Ballingall, 1983a et 1983b ; Shirley et Bellatti, 1984 ; Shirley et al., 1984 ; McDonald et al., 1986). Les capacités immunogènes de ces souches étant intactes, des vaccins vivants atténués ont pu être élaborés -Paracox (Mallinckrodt), Livacox (Biopharm)- et sont utilisés avec succès sur le terrain (Williams, 1992 ; Williams et al., 1999). Chez le lapin, plusieurs souches ont pu être obtenues et nous disposons actuellement des souches précoces d'E. intestinalis, d'E. media, d'E. magna et d'E. coecicola (Licois et al., 1990 ; 1994 ; 1995). L'obtention de ces souches nécessite de sélectionner, au cours des cycles parasitaires successifs, les premiers oocystes produits jusqu'à obtenir une souche dont la période prépatente est plus courte que celle de la souche sauvage d'origine. Le pouvoir pathogène des souches précoces est considérablement diminué comparé à celui des souches sauvages et des modifications morphologiques des oocystes apparaissent. Ainsi, pour E. media précoce, les oocystes sporulés contiennent bien 4 sporocystes identiques mais chaque sporocyste ne présente qu'un seul corps réfringent, externe aux sporozoïtes, et non un globule réfringent par sporozoïte comme dans la souche d'origine (Licois et al., 1995). Des travaux ont été réalisés sur la comparaison des cycles parasitaires des souches précoces et sauvages avec E. media et E. magna (Licois et al., 1994 ; Pakandl et al., 1996a et 1996c). Pour ces 2 espèces, la dernière mérogonie manque dans le cycle de la souche précoce. Des essais de vaccination sur le terrain avec la souche E. magna précoce ont donné des résultats très encourageants (Drouet-Viard et al., 1997a et 1997b). Un des objectifs actuels est de produire un vaccin constitué des espèces pathogènes les plus fréquemment rencontrées en élevage : E. magna, E. media, et éventuellement E. intestinalis et E. flavescens. A l'avenir d'autres types de vaccination moins coûteux et efficaces contre l'ensemble des espèces seraient souhaitables (Vermeulen, 1998). Pour améliorer les moyens de lutte contre les coccidies une meilleure connaissance du cycle parasitaire et des relations hôtes-parasites est une étape préliminaire qui semble indispensable.


Invasion de l'organisme


Mécanisme de pénétration des Apicomplexa dans les cellules hôtes

      Les Eimeria sont des protozoaires parasites intracellulaires obligatoires qui se caractérisent par la présence d'un complexe apical impliqué dans le processus de pénétration active du parasite dans la cellule hôte. Les principaux mécanismes d'invasion semblent communs à l'ensemble du phylum des Apicomplexa et ont été particulièrement bien décrits chez Plasmodium sp. ou Toxoplasma gondii.

      Les stades invasifs du parasite (sporozoïte, mérozoïte) se développent dans des vacuoles parasitophores qui se forment au cours de la pénétration des sporozoïtes ou des mérozoïtes dans la cellule hôte (Entzeroth et al., 1998). La membrane vacuolaire ne fusionne pas avec le compartiment lysosomal et n'interagit pas avec les voies d'endocytose ou d'exocytose de la cellule hôte (Lingelbach et Joiner, 1998 ; Mordue et al., 1999). Des pores non sélectifs dans la membrane parasitophore permettent au parasite de capter les métabolites dont il a besoin. La membrane agit comme un tamis moléculaire perméable à des molécules inférieures à 1,4 KDa chez T. gondii (Schwab et al., 1994) et comprises entre 850 et 10000 Da chez E. nieschulzi (Werner-Meier et Entzeroth, 1997). La vacuole est en contact étroit avec le réticulum endoplasmique et les mitochondries de la cellule hôte ; cette association semble mettre en jeu des interactions protéine-protéine et permet vraisemblablement de fournir des métabolites essentiels au parasite, comme par exemple les purines (Sinai et al., 1997).

      L'invasion de la cellule hôte est un phénomène actif de la part du parasite et qui met en jeu les différents organites du complexe apical de façon séquentielle (Dubremetz et al., 1993 ; Carruthers et Sibley, 1997). La première étape de ce processus correspond à la reconnaissance entre parasite et cellule hôte. La motilité actino-dépendante du parasite ainsi que les protéines des micronèmes interviennent dans ce processus (Kawazoe et al., 1992 ; Chobotar et al., 1993 ; Dobrowolski et Sibley, 1996 ; Tomley et al., 1996 ; Sultan et al., 1997). Une fois le contact initié, l'internalisation est immédiate et dure 5 à 10 secondes. Le parasite s'oriente par rapport à la membrane cellulaire. On observe alors l'extension du conoïde et la mise en place d'une jonction mobile résultant de l'accolement étroit des plasmalemmes de la cellule hôte et du parasite. Cette jonction mobile permet le passage des lipides de la cellule hôte vers la membrane vacuolaire qui se forme en avant de la jonction, mais pas le passage des particules membranaires. La membrane de la cellule hôte participe pour 80% à la formation de la membrane vacuolaire, les 20% restant provenant vraisemblablement de l'exocytose du contenu des rhoptries concomitante à l'invasion (Ward et al., 1993). Les protéines vacuolaires proviennent des rhoptries et participent à la formation des pores membranaires (Dubremetz et al., 1993 ; Greif et Entzeroth, 1996 ; Carruthers et Sibley, 1997 ; Rick et al., 1998). Les granules denses sont impliqués dans la maturation de la membrane parasitophore et les protéines exocytées s'associent à la membrane vacuolaire ou aux structures intra-vacuolaires (Saffer et al., 1992 ; Beckers et al., 1994 ; Daszak, 1999 ; Labruyere et al., 1999). Les différentes phases d'exocytose des micronèmes, rhoptries et granules denses sont des processus calcium-dépendants (Pezzella et al., 1997 ; Bouchot et al., 1999 ; Carruthers et Sibley, 1999). Le relargage progressif de calcium serait également responsable de la réactivation du parasite lors de sa sortie de la cellule hôte (Bouchot et al., 1999).


Spécificité d'hôte, de site et de cellule


Spécificité d'hôte

      Les Eimeria sont des parasites monoxènes qui possèdent une très grande spécificité d'hôte (Joyner, 1982). Cette notion de spécificité est restée floue pendant un certain nombre d'années. En effet, la diagnose basée uniquement sur la morphologie des oocystes, les techniques de purification de souches peu performantes, et l'utilisation d'animaux non indemnes de coccidies ont donné lieu à des controverses.

      Des essais d'inoculation de parasites à des espèces qui ne sont pas leurs hôtes naturels ont abouti au développement incomplet des parasites chez ces hôtes (Haberkorn, 1970). Cependant, E. arloingi a longtemps été considérée comme une espèce infectant à la fois le mouton et la chèvre (Lotze et al., 1964 ; Lima, 1979). D'autres travaux réalisés avec cette même espèce ont montré depuis que les oocystes isolés chez la chèvre n'achèvent pas leur cycle chez le mouton ; il s'agit donc bien de 2 espèces distinctes. De même, E. contorta décrite par Haberkorn (1971) comme infectant à la fois le rat et la souris s'est avérée être un mélange d'E. nieschulzi et E. falciformis (Stockdale et al., 1979). Il semble donc que les Eimeria possèdent une très forte spécificité d'hôte ; E. stiedai et E. neoleporis (coecicola) qui se développent de la même façon chez le lapin européen, Oryctolagus cuniculus, et le lapin américain, Sylvilagus sp. constitueraient une des rares exceptions décrites (Levine et Ivens, 1972) mais cela reste à confirmer.

      Des traitements immunodépresseurs permettent parfois l'aboutissement du cycle chez un hôte habituellement non permissif ; Todd et Lepp (1972) ont ainsi obtenu le développement complet d'E. vermiformis chez le rat. Cependant, sans achever son cycle, le parasite peut rester vivant chez un hôte non spécifique, notamment au niveau extra-intestinal. Ainsi, E. tenella, espèce parasite du poulet, est retrouvée dans différents organes de la souris, 1 à 7 jours après inoculation per os. Les parasites présents chez la souris sont susceptibles de reproduire la maladie chez des poulets indemnes de coccidies (Naciri et Yvoré, 1982). La même expérience peut être reproduite à partir de poumons de souris infectées par E. acervulina, E. maxima et E. tenella (Naciri et Yvoré, 1986). Des sporozoïtes issus d'Eimeria de poulet peuvent également être observés dans les cellules du sang périphérique chez la dinde (Kogut et Long, 1984). Ces observations montrent que, bien que le parasite n'achève pas son cycle chez un hôte non spécifique, il peut cependant être disséminé dans l'organisme de ce dernier, et vraisemblablement y rester à l'état latent un certain laps de temps.


Spécificité de site de développement

      Une des caractéristiques des Eimeria est leur très forte spécificité tissulaire.

      Chez le lapin, les 11 espèces d'Eimeria décrites possèdent chacune leur propre spécificité tissulaire (Fig 5) ; cette spécificité peut d'ailleurs être utilisée pour la diagnose. E. stiedai possède un tropisme particulier pour les canaux biliaires du foie. E. coecicola se développe dans le GALT, dont l'appendice vermiforme, le Sacculus rotundus et les plaques de Peyer. E. intestinalis se développe dans les cellules épithéliales du jéjunum distal et de l'iléon. Dans certains cas, comme pour E. flavescens, les différents stades parasitaires peuvent avoir une spécificité tissulaire différente (Norton et al., 1979). La 1ère génération de mérontes se développe dans les glandes de Lieberkühn de l'intestin grêle distal. Les mérozoïtes migrent ensuite vers le caecum et le côlon où ils se développent dans l'épithélium superficiel jusque la 4ème génération. La dernière multiplication et la gamogonie se déroulent dans l'épithélium glandulaire.

      

Fig. 5 : Spécificité tissulaire des Eimeria du Lapin (d'après Coudert et al., 2000)

      Les 7 espèces parasitaires décrites chez le poulet présentent aussi une importante spécificité de site (Tab 4). Cependant, cette spécificité est plus ou moins stricte en fonction de l'espèce parasitaire et des conditions d'inoculation (Horton-Smith et Long, 1965 et 1966 ; Long et Millard, 1976).

      

Tab. 4 : Spécificité tissulaire et pathogénicité des différentes espèces d'Eimeria infectant le Poulet.

      Il existe des espèces d'Eimeriase développant dans d'autres organes que l'intestin. Chez les oiseaux certaines espèces ont été rapportées comme étant à l'origine d'infections rénales : E. boschadis chez le colvert, E. christianseni chez le cygne et E. truncata chez l'oie (Pellérdy, 1974 ; Gajadhar et al., 1983a et 1983b). Chez les mammifères, le développement de certaines espèces d'Eimeria hors de l'intestin a été observé soit dans les canaux biliaires, E. stiedai chez le lapin, E. hiepei chez le vison (Gräfner et al., 1967), et chez le chamois et le porc (Desser, 1978), soit dans le tractus génital femelle (présence de gamètes et d'oocystes sporulés d'E. neitzi dans l'épithélium utérin des impalas ; McCully et al., 1970). Mises à part E. stiedai et E. truncata dont le développement a été largement étudié, les autres travaux montrant la présence extra-intestinale de formes de multiplication d'Eimeria sont rares et sporadiques et nécessiteraient d'être confirmés et approfondis.

      Certaines espèces parasitaires semblent avoir un développement à la fois intra et extra- intestinal. Chez la grue (Grus americana et G. canadensis), les infections intestinales provoquées par E. reichenowi et E. gruis peuvent être accompagnées d'une large dissémination systémique (Carpenter et al., 1980). Des stades parasitaires asexués sont retrouvés dans les macrophages des poumons, du foie, de la rate et du myocarde ; des oocystes d'E. reichenowi sont retrouvés à la fois dans l'intestin et les poumons de grues naturellement infectées (Novilla et al., 1981). Un schéma du cycle parasitaire pour ces 2 espèces d'Eimeria a été proposé par Novilla et al (1981, Fig 6). Des stades asexués et sexués étant observés dans les cellules épithéliales bronchiques, les auteurs ont suggéré que les poumons pouvaient être une source d'oocystes susceptibles de se développer dans l'intestin ultérieurement. Bien que la présence d'une phase parasitémique ne soit pas démontrée, les auteurs suggèrent l'existence probable d'une phase sanguine avec une réinfection possible de l'intestin à partir des mérozoïtes présents dans les sites extra-intestinaux. De même, des stades parasitaires asexués et sexués d'Eimeria ont été décrits par Lima (1979) dans les ganglions mésentériques de 2 chevreaux naturellement infectés par E. arloingi, E. christenseni et E. crandallis, espèces qui se développent également dans l'intestin. Ces cas de figure où des formes de multiplication d'Eimeria sont retrouvées à la fois dans l'intestin et dans des sites extra-intestinaux restent malgré tout rares et font l'objet d'un petit nombre de publications.

      

Fig. 6 : Schéma hypothétique du cycle parasitaire d'Eimeria reichenowi et d'Eimeria gruis infectant la Grue (d'après Novilla et al., 1981)

      Le tropisme spécifique vers les tissus et les cellules cibles a été démontré expérimentalement par des inoculations parentérales des différentes formes parasitaires : oocystes sporulés, sporozoïtes, mérozoïtes. L'inoculation intramusculaire (IM), intra-péritonéale (IP) et intraveineuse (IV) d'E. nieschulzi chez le rat (Landers, 1960) ou l'injection sous-cutanée (SC), IM, IP ou IV d'E. acervulina, E. maxima, E. necatrix et E. tenella chez le poulet (Davies et Joyner, 1962 ; Sharma et Reid, 1962 ; Sharma, 1964) aboutit au développement du parasite au niveau de son site spécifique intestinal ou cæcal. Chez le lapin, Pellérdy (1969) a montré qu'une coccidiose hépatique pouvait être expérimentalement induite après injection IM, IP et IV d'oocystes sporulés d'E. stiedai.

      Toutes ces expérimentations montrent le fort tropisme du parasite pour son site tissulaire spécifique. Farr et Doran (1962) avaient émis l'hypothèse que la spécificité du site de développement était liée au lieu d'excystation du parasite conditionné par le temps nécessaire à l'excystation. Les expériences d'injections parentérales décrites ci-dessus tendraient plutôt à prouver que la spécificité est davantage liée aux caractéristiques physiologiques locales des différents tissus (Joyner, 1982).

      Cependant, l'inoculation de fortes doses d'oocystes peut placer l'hôte dans des conditions non naturelles d'hyperparasitisme, les parasites envahissant alors des sites atypiques de développement (Joyner, 1982). De même, des traitements immunosuppresseurs peuvent lever en partie la spécificité de site et permettre une éventuelle dissémination des parasites dans l'organisme (Long et Rose, 1970 ; Rose et Hesketh, 1986).


Spécificité cellulaire

      Les Eimeria possèdent une forte spécificité cellulaire. La majorité des espèces se développe dans les cellules épithéliales d'origine endodermale de l'intestin, mais également des canaux biliaires, du rein ou du poumon. Le développement de certaines Eimeria (E. neitzi) dans l'utérus constitue une exception à cette règle (McCully et al., 1967 et 1970) : le développement se déroule bien dans des cellules épithéliales mais d'origine mésodermale. Pour les espèces à tropisme intestinal, la localisation des différents stades parasitaires est variable selon l'espèce et selon le stade parasitaire considéré. Ainsi, chez le poulet, E. brunetti et E. praecox se développent dans les entérocytes du sommet des villosités intestinales (Fernando et al., 1987) alors que les autres espèces se développent dans les entérocytes des cryptes (Van Doorninck et Becker, 1957 ; Challey et Burns, 1959 ; Pattillo, 1959 ; Doran, 1966). Les différentes étapes du cycle peuvent se dérouler dans des types cellulaires différents. Les mérozoïtes d'E. flavescens se développent, de la 2ème à la 4ème génération, dans la partie luminale de l'épithélium des cryptes alors que la gamogonie se déroule dans les cellules glandulaires. Un exemple plus atypique est celui d'E. coecicola qui est la seule espèce d'Eimeria du lapin, et la deuxième espèce d'Eimeria décrite avec E. dispersa chez la dinde (Millard et Lawn, 1982), dont la première mérogonie a lieu dans des cellules lymphoïdes du GALT, les mérogonies suivantes s'effectuant dans les entérocytes.


Transport du parasite dans l'organisme

      Pour de nombreuses espèces d'Eimeria à développement intestinal, la présence extra-intestinale du parasite au cours de la phase d'invasion a pu être démontrée.

      Pasternak et Fernando (1984) ont été les premiers à montrer la présence extra-intestinale de sporozoïtes d'E. tenella dans des lymphocytes du foie et de la rate. D'autres travaux ont montré également la présence extra-intestinale d'E. tenella, E. acervulina, E. necatrix, E. brunetti et E. praecox dans le sang, le foie, les poumons et le myocarde des poulets infectés par voie orale (Kogut et Long, 1984). La démonstration de la présence de parasites vivants et infectants dans les différents organes a été effectuée par inoculation per os d'homogénats tissulaires issus de poulets infectés (animaux donneurs) à des poulets indemnes (animaux receveurs), et mesure de l'excrétion d'oocystes des animaux receveurs ; seule la rate s'est avérée ne pas être infectée. Ces travaux ont été confirmés et développés par la suite par Al-Attar et Fernando (1987) et Fernando et al. (1987). Chez le lapin infecté par E. stiedai, la transfusion de sang permet de transférer l'infection aux animaux donneurs (Fitzgerald, 1972 et 1974). Ainsi, bien que la spécificité tissulaire des Eimeria soit importante, la présence extra-intestinale de sporozoïtes est un phénomène assez répandu et la dissémination peut se faire dans tout l'organisme de l'hôte. En revanche, la présence de formes de multiplication extra-intestinales chez les Eimeria à tropisme intestinal est beaucoup plus anecdotique.

      Dans le cas des coccidies du poulet, il est communément admis que les sporozoïtes entrent directement dans les cellules épithéliales des villosités de l'organe cible. Le parasite est ensuite transporté à l'intérieur d'une cellule, au sein d'une même villosité, jusqu'aux cellules des cryptes dans lesquelles se déroulent son développement ultérieur. Les cellules vectrices d'E. necatrix (Van Doorninck et Becker, 1957), d'E. tenella (Challey et Burns, 1959 ; Pattillo, 1959) et d'E. acervulina (Doran, 1966 ; Michael, 1976) avaient tout d'abord été identifiées comme étant des macrophages. Plus récemment, ces cellules transporteuses ont été caractérisées comme étant des lymphocytes intra-épithéliaux (Lawn et Rose, 1982 ; Al-Attar et Fernando, 1987 ; Fernando et al., 1987). La recherche du phénotype de ces lymphocytes a montré que les sporozoïtes d'E. acervulina sont transportés par des lymphocytes T, essentiellement CD8+ (Trout et Lillehoj, 1993 et 1995) mais aussi par les lymphocytes T-CD4+ et par les macrophages mais pas par les lymphocytes B. Vervelde et al. (1995) ont observé que 50% des sporozoïtes d'E. tenella présents dans les leucocytes sont dans des lymphocytes T, essentiellement CD8+. Des parasites étaient également observés dans les macrophages, et parfois dans les lymphocytes B, mais globalement seuls 12% des sporozoïtes se trouvaient dans des leucocytes de l'épithélium ou de la lamina propria.

      Chez le lapin, il a été mis en évidence pour au moins 4 espèces d'Eimeria que la pénétration du sporozoïte a lieu dans le duodénum alors que l'organe cible peut être parfois très éloigné (Horton, 1967 ; Pakandl et al., 1993 ; Drouet-Viard et al., 1994b ; Pakandl et al., 1995) : les cellules du GALT et en particulier l'appendice vermiforme, le Sacculus rotundus et les plaques de Peyer pour E. coecicola, l'iléon pour E. intestinalis.

      Le cycle d'E. coecicola a été bien étudié en microscopie électronique (Pakandl et al., 1993 et 1996b). Après injection intraduodénale de sporocystes, les sporozoïtes excystent très rapidement et entrent dans les cellules épithéliales du duodénum. Dans les heures qui suivent, ils sont observés dans les cellules lymphoïdes de la lamina propria de ce segment. De l'inoculation jusqu'à 48 heures post-inoculation le nombre de parasites dans le duodénum décroît alors qu'ils apparaissent dans les cellules lymphoïdes du GALT dans lesquelles ils entament leur première mérogonie. Les mérogonies suivantes se déroulent dans les cellules épithéliales des dômes. L'observation d'une mérogonie dans des cellules lymphoïdes est une particularité d'E. coecicola qui n'est retrouvée chez aucune autre espèce du lapin.

      Le cycle et la migration d'E. intestinalis ont également été bien étudiés (Licois et al., 1992a ; Drouet-Viard et al., 1994b). Les sporozoïtes pénètrent dès les 10 premières minutes dans l'épithélium du duodénum ; 6 heures plus tard, un nombre considérable est observé dans la muqueuse iléale tandis que la quantité présente dans la muqueuse duodénale a beaucoup diminué.

      Une des différences fondamentales entre les cycles des Eimeria du lapin et ceux du poulet, est la distance parcourue par le sporozoïte de son site de pénétration dans la muqueuse intestinale jusqu'à son site de développement.


Organisation du système lymphoïde associé aux muqueuses

      L'organisation du système lymphoïde chez le lapin est globalement la même que chez les autres mammifères. On distingue les organes lymphoïdes primaires, sièges de la lymphopoïèse et de la maturation des lymphocytes, des organes lymphoïdes secondaires, sièges de leur stimulation et de leur prolifération.

      Les organes lymphoïdes primaires sont le thymus, dans lequel se différencient les lymphocytes T, et la moelle osseuse, dans laquelle se différencient les lymphocytes B. La rate, les ganglions lymphatiques et le tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT) constituent les organes lymphoïdes secondaires.

      La plupart des Eimeria du lapin, et en particulier E. coecicola et E. intestinalis, se développant dans l'intestin, nous décrirons plus particulièrement la muqueuse intestinale et le tissu lymphoïde qui lui est associé. L'organisation de la rate et des ganglions mésentériques du lapin est semblable à celle de la plupart des mammifères (Weinstein et Anderson, 1998a). En revanche, le système lymphoïde associé à la muqueuse intestinale possède une particularité, le développement considérable de l'appendice vermiforme. Cet organe intervient en tant qu'organe lymphoïde primaire dans la production et la maturation des lymphocytes B chez le jeune lapereau et en tant qu'organe lymphoïde secondaire dans l'induction de la réponse immunitaire spécifique.

      Toutes les muqueuses de l'organisme possèdent un tissu lymphoïde associé : le NALT associé au tractus respiratoire supérieur, le BALT associé au tractus respiratoire profond et le GALT associé au tractus gastro-intestinal et urogénital. Le rôle premier du MALT est d'assurer la défense de l'hôte contre les pathogènes et d'assurer la protection des muqueuses en régulant la réponse inflammatoire.

      La muqueuse intestinale constituant la voie d'entrée des Eimeria dans l'organisme et, pour la majorité d'entre elles, le site de développement, nous nous intéresserons donc plus particulièrement à l'organisation du GALT.

      La muqueuse intestinale est une surface d'échange importante avec le milieu extérieur au niveau de laquelle sont absorbés les nutriments. Elle constitue également une barrière physiologique et immunologique contre un grand nombre de miro-organismes et de substances étrangères. La régulation de la réponse immune dans la muqueuse intestinale est particulièrement complexe. D'une part, la charge antigénique dans l'intestin est importante et des mécanismes de tolérance doivent être induits vis-à-vis de la plupart des antigènes. D'autre part, des mécanismes immunitaires non spécifiques et adaptatifs doivent pouvoir se mettre en place lors de l'invasion par un micro-organisme. Dans des conditions physiologiques normales, un équilibre homéostatique est maintenu et les processus inflammatoires régulés.

      Plusieurs facteurs non immunologiques permettent d'assurer la défense des muqueuses : la flore saprophyte résidente et les sécrétions digestives créent un environnement défavorable à la croissance des agents pathogènes. Le péristaltisme intestinal, le mucus et le glycocalyx permettent de réduire les interactions entre agents pathogènes et cellules épithéliales. Certaines substances (la lactoferrine, la lactoperoxidase et le lysozyme) peuvent avoir une activité inhibitrice sur le développement des agents pathogènes. Enfin, l'épithélium cohésif et les jonctions étroites entre cellules épithéliales empêchent le passage intercellulaire des agents pathogènes.

      Lorsque ces mécanismes ne permettent pas l'élimination de l'agent pathogène, des mécanismes immunitaires de défense peuvent se mettre en place. Le système lymphoïde associé au tube digestif (GALT) contient à lui seul plus de cellules immunitaires que le reste de l'organisme.

      Le GALT peut être morphologiquement et fonctionnellement divisé en 2 parties :


Sites inducteurs de la réponse immune mucosale

      A la différence de la plupart des mammifères, chez lesquels les sites inducteurs de la réponse immunitaire mucosale sont principalement constitués par les plaques de Peyer, le lapin possède 2 autres structures particulièrement développées, le Sacculus rotundus et l'appendice vermiforme, dans lesquelles la réponse immune peut être induite.

      Le tissu lymphoïde de l'appendice vermiforme, du Sacculus rotundus et des plaques de Peyer est constitué de follicules lymphoïdes, surmontés d'un dôme et d'un épithélium spécialisé (épithélium associé aux follicules, FAE), séparés par des zones interfolliculaires (Fig 7, Bockman, 1983).

      

Fig. 7 : Coupe histologique d'appendice vermiforme de lapin (d'après Bockman, 1983). D : Dome ; C : Corona ; T : aire thymo-dépendante interfolliculaire ; G : centre germinatif.

      Les follicules sont organisés en un centre germinatif et une corona qui contiennent essentiellement des lymphocytes B-IgM+ (Ermak et al., 1994), mais également des macrophages et des lymphocytes T CD4+ (Ermak et al., 1994). Le ratio des lymphocytes IgM+/CD4+ et IgM+/IgA+ diminue dans le dôme qui surplombe la corona (Ermak et al., 1994 ; Weinstein et Anderson, 1998a).

      Les zones interfolliculaires constituent les aires T-dépendantes riches en lymphocytes T CD4+ et CD8+ et en macrophages. C'est à ce niveau que pénètrent les lymphocytes sanguins dans la muqueuse.

      L'épithélium associé aux follicules est un épithélium très spécialisé qui a été particulièrement bien décrit chez le lapin. Il se différencie de l'épithélium intestinal, par l'absence de cellules à mucus, l'absence de sécrétion du récepteur des IgA dimériques (Pappo et Owen, 1988) et d'activité phosphatase alcaline (Owen et Bhalla, 1983), par sa capacité à fixer les lectines (Neutra et al., 1987) et par la présence de cellules épithéliales particulières, les cellules M (M pour microfold). Chez le lapin, les cellules M représentent 50% des cellules de l'épithélium associé aux follicules contre seulement 10% chez les rongeurs (Pappo, 1989).

      Les cellules M se caractérisent par la présence de microvillosités atrophiées et irrégulières ainsi que par un glycocalyx et une couche de mucus clairsemés facilitant l'accès de leur membrane apicale aux antigènes luminaux (Owen et Jones, 1974). La membrane basolatérale de ces cellules est profondément invaginée et forme une poche intra-épithéliale dans laquelle viennent se loger des lymphocytes et des macrophages. Les cellules M captent une grande variété d'antigènes et de microorganismes et les rendent accessibles à ces cellules lymphoïdes. Ainsi, des antigènes solubles (Bockman et Cooper, 1973) mais également des virus (Wolf et al., 1981), des bactéries (Inman et Cantey, 1984 ; Owen et al., 1986), des protozoaires (Marcial et Madara, 1986) et des microsphères de 10 nm à 10 µm (Pappo et Ermak, 1989 ; Ermak et al., 1995), sont susceptibles d'être transportés par ces cellules de la lumière intestinale vers le tissu lymphoïde sous-jacent. L'efficacité du transport semble liée aux capacités d'adhérence des particules à la surface de ces cellules (Neutra et al., 1987). Les cellules M du lapin assurent un transport plus efficace que celui des cellules M des rongeurs (Pappo et Ermak, 1989). Les antigènes luminaux délivrés aux cellules lymphoïdes présentes dans la poche intra-épithéliale peuvent être ensuite captés par les cellules présentatrices d'antigènes et acheminés vers les centres germinatifs.

      Ermak et al. (1990, 1994) ont montré que les lymphocytes présents dans l'épithélium associé aux follicules possèdent un phénotype particulier. En effet, ces lymphocytes sont très majoritairement CD43+ (65% dans les plaques de Peyer, 95% dans l'appendice), expriment des molécules de classe II du CMH, ainsi que les marqueurs de surface CD18 et CD58, mais sont CD4--CD8--. Ces cellules constituent une population de lymphocytes T activés, différente de celles présentes dans le dôme, dans les aires T-dépendantes, ainsi que dans l'épithélium et la lamina propria des villosités. Il s'agirait en réalité de cellules dendritiques (Weinstein et Anderson, 1998b).

      La captation des antigènes par les macrophages ou les cellules dendritiques des dômes et des follicules permet l'activation des lymphocytes et l'induction de la réponse immunitaire spécifique.

      L'appendice vermiforme joue non seulement un rôle dans l'induction de la réponse immune mais il constitue également un organe essentiel dans la production des lymphocytes B au cours des premières semaines de la vie du lapereau (Reynaud et Weill, 1996 ; Pospisil et Mage, 1998). Ces lymphocytes B, dont la différenciation se fait dans l'appendice au contact de la microflore intestinale (Fuschiotti et al., 1997 ; Lanning et al., 2000), migrent secondairement dans le reste de l'intestin et en particulier dans les plaques de Peyer. L'appendice est essentiel à la diversification du répertoire des immunoglobulines et au développement du système immunitaire mucosal (Dasso et Howell, 1997 ; Vajdy et al., 1998).


Sites effecteurs de la réponse immune mucosale

      En dehors des tissus lymphoïdes organisés, beaucoup de cellules lymphoïdes sont réparties dans la lamina propria et dans l'épithélium de l'intestin. La réponse immune effectrice peut donc se développer tout le long du tractus intestinal.

      Les cellules épithéliales sont constituées principalement de 4 types cellulaires dérivant des cellules souches multipotentes logées dans les cryptes et qui participent à la restauration et au maintien de l'intégrité de l'épithélium (Gebbers et Laissue, 1989).

  • Les cellules absorbantes constituent la majorité des cellules de l'épithélium digestif (90%) et jouent un rôle fondamental dans l'absorption des nutriments.
  • Les cellules de Paneth sont localisées dans les cryptes et sécrètent des granules riches en lysozyme possédant une forte activité bactériolytique et des peptides antibiotiques tels que la cryptidine.
  • Les cellules à mucus contribuent à la formation d'une couche protectrice à la surface des entérocytes.
  • Les cellules entéroendocriniennes relarguent des hormones en réponse aux changements d'environnement au niveau des capillaires du tissu conjonctif.

      Toutes ces cellules, hormis les cellules de Paneth, migrent des cryptes vers le sommet des villosités et sont expulsées dans la lumière en 2 à 3 jours.

      Les entérocytes qui constituent les cellules absorbantes de l'épithélium intestinal sont également impliqués dans les mécanismes de protection immunitaires. Ces cellules assurent la transcytose des IgA sécrétoires (IgAs) de leur site de synthèse, les plasmocytes de la lamina propria, jusqu'à la lumière intestinale. Des récepteurs aux IgA dimériques sont synthétisés et exprimés dans leur membrane basolatérale ; les complexes récepteur-Ig sont internalisés par endocytose, transportés à travers le cytoplasme et relargués dans la lumière intestinale (Brandtzaeg, 1995). Le clivage du récepteur au pôle apical de la cellule libère la pièce sécrétoire qui masque ainsi les sites de clivage protéolytique sur la molécule d'IgAs (Mostov, 1994). Les IgAs représentent l'isotype prédominant des muqueuses et préviennent l'attachement des microorganismes et antigènes luminaux aux épithéliums (Gebbers et Laissue, 1989). Une des particularités du lapin est qu'il possède 13 gènes fonctionnels différents pour la chaîne Ca des immunoglobulines A, alors que les autres mammifères n'en possèdent qu'un ou deux (Burnett et al., 1989). Les entérocytes expriment également les molécules de classe I et II du CMH et sont capables de produire certaines cytokines.

      Les lymphocytes intra-épithéliaux (LIE) sont également une constituante essentielle de l'épithélium intestinal. Ils se localisent au-dessus de la lame basale entre les entérocytes. A leur surface, l'intégrine aEb7 permet la fixation à une adressine présente sur les cellules épithéliales, l'E-cadhérine (Cepek et al., 1994). Chez la souris 90% des LIE sont des lymphocytes T et 90% expriment la molécule CD8 (Guy-Grand et Vassalli, 1993). Parmi ces lymphocytes CD8+, on distingue 2 populations selon la nature homo- ou hétéro- dimérique de la molécule CD8. La population CD8ab+ porte le récepteur TCR ab, est thymo-dépendante et est identique à celle que l'on trouve dans les organes lymphoïdes. La population CD8aa+ est en revanche atypique. Elle représente près de 60% des LIE CD8+, est thymo-indépendante et possède en majorité le récepteur TCRgd (Guy-Grand et al., 1991 ; Guy-Grand et al., 1996). Ces lymphocytes ont une cytotoxicité non restreinte par les molécules du CMH. La présence de granulations intracytoplasmiques riches en perforine, granzymes et Fas-Ligand atteste de l'activité cytotoxique des LIE (Guy-Grand et al., 1996).

      La muqueuse intestinale est constituée, dans sa partie sous-jacente, d'une couche de tissu conjonctif formant le chorion ou lamina propria contenant des cellules musculaires lisses, des fibroblastes, des vaisseaux sanguins et lymphatiques ainsi que des cellules lymphoïdes. Chez la souris, les plasmocytes à IgA constituent en moyenne 40% des cellules de la lamina propria (Spieker-Polet et al., 1999). Les lymphocytes T présents sont essentiellement CD4+ TCRab (Akbar et al., 1988 ; Trout et Lillehoj, 1996) et expriment des marqueurs de cellule mémoire (Akbar et al., 1988).


Réponse immunitaire de l'hôte contre les Eimeria

      Les Eimeria sont des protozoaires parasites monoxènes qui possèdent une grande spécificité d'hôte. De manière générale, et plus particulièrement pour les Eimeria du lapin, une infection primaire confère une solide immunité contre la réinfection (Rose, 1974 ; Licois et al., 1992b ; Coudert et al., 1993). Cependant, malgré la présence d'antigènes communs aux différentes espèces parasitaires et la présence de clones lymphocytaires dirigés contre ces antigènes, il n'y a pas d'immunité croisée entre les différentes espèces et parfois même entre 2 souches d'une même espèce (Coudert et al., 1990 ; Prowse, 1991 ; Licois et al., 1992b). Tous les stades parasitaires sont immunogènes bien que les stades les plus précoces le soient davantage (McDonald et al., 1988). Ainsi, les souches d'Eimeria dites 'souches précoces' chez lesquelles les dernières mérogonies disparaissent sont moins pathogènes mais sont, malgré tout, immunogènes (Shirley et Bellatti, 1984 ; Shirley et al., 1984 ; Licois et al., 1995 ; Drouet-Viard et al., 1997a et 1997b ; Williams et al., 1999).

      Tant chez le poulet que chez le lapin, l'acquisition de l'immunité permet un arrêt du développement du parasite au cours de la réinfection. Les mécanismes mis en jeu semblent dépendre de l'espèce parasitaire. Chez le poulet, l'inhibition de la pénétration dans la muqueuse n'est constatée que dans certains cas (Augustine et Danforth, 1986) ; après pénétration dans la muqueuse intestinale, seuls quelques parasites sont retrouvés au niveau des cryptes. Dans tous les cas leur développement ultérieur est arrêté ; il semblerait que les sporozoïtes restent bloqués dans les lymphocytes assurant leur transport vers les cellules hôtes (Riley et Fernando, 1988 ; Vervelde et al., 1993 ; Trout et Lillehoj, 1995).

      Lors d'une infection parasitaire, une réponse immunitaire non spécifique mais également une réponse spécifique à la fois humorale et cellulaire se développent. Il n'est pas toujours facile suivant les modèles parasitaires et animaux de déterminer la part des différents mécanismes immunologiques dans la protection. Dans la plupart des cas, l'immunité cellulaire semble jouer un rôle prépondérant dans l'acquisition de l'immunité contre les coccidies.

      Chez le lapin, les mécanismes immunitaires mis en jeu au cours de la coccidiose n'ont jamais été étudiés jusqu'à maintenant. La réponse immunitaire contre les Eimeria a été étudiée essentiellement chez le poulet ou la souris. Une littérature abondante concernant le développement des mécanismes immunitaires dans d'autres modèles d'infection parasitaire (comme Toxoplasma gondii dans le modèle murin) existe également. Aussi, la plupart des résultats qui suivent feront référence à des mécanismes de résistance contre les infections par les coccidies, élucidés avec le modèle murin ou chez le poulet.


Déclenchement de la réponse immune intestinale

      La première barrière rencontrée par les pathogènes à voie d'entrée intestinale dans l'organisme est l'épithélium. Les entérocytes sont les premières cellules sollicitées et pourraient être à l'origine du déclenchement de la réponse immunitaire.

      Les entérocytes infectés sont capables de synthétiser des chimiokines et cytokines pro-inflammatoires, comme l'IL-1, l'IL-8, le TNF-a (Seydel et al., 1997), qui jouent un rôle dans l'attraction des neutrophiles et des lymphocytes T CD8+ (Baggiolini et al., 1994 ; Roberts et al., 1997). La réponse inflammatoire provoque une surexpression des molécules de classe II du CMH par les entérocytes qui pourraient alors présenter l'antigène aux lymphocytes sous-jacents (Mayer et al., 1991). Ces cellules peuvent également participer directement à l'élimination des parasites en induisant la synthèse d'oxyde nitrique (NO), molécule qui possède une large activité anti-microbienne contre les pathogènes intestinaux (James, 1995 ; Clark et Rockett, 1996 ; Fang, 1997).

      Les macrophages, attirés par certaines chimiokines, notamment le MCP-1, produisent en réponse à leur activation, des cytokines inflammatoires comme le TNF-a, l'IFN-g ou l'IL-1. Ils ont également des fonctions microbicides et microbiostatiques impliquant la production de radicaux libres de l'oxygène (H2O2, OH·, O·,O2·, O2-) (Nathan et al., 1983) ou de dérivés nitrés. Il a ainsi été montré, dans le cas d'infections par E. tenella, que l'activation des macrophages par l'IFN-g induit la production de NO et inhibe le développement des parasites in vitro dans des fibroblastes (Dimier et al., 1998 ; Dimier-Poisson et al., 1999). Les macrophages jouent également un rôle important dans l'apprêtement et la présentation des antigènes aux lymphocytes et donc dans la mise en place de l'immunité spécifique.

      Les cellules dendritiques, qui peuvent également être attirées par des molécules chimioattractives (Kelsall et Strober, 1997), sont capables de présenter les antigènes exogènes, associés aux molécules de classe II du CMH, aux lymphocytes T-CD4+. Chez la souris ce sont essentiellement ces cellules qui jouent le rôle de cellules présentatrices d'antigènes dans les plaques de Peyer. Contrairement aux macrophages, les cellules dendritiques semblent impliquées dans la synthèse précoce d'IL-12 (Scharton-Kersten et al., 1996) sans activation préalable par l'IFN-g (Reis e Sousa et al., 1997 ; Bourguin et al., 1998).

      Les cellules NK interviennent au cours de la phase précoce de l'infection en produisant de l'IFN-g suite à leur activation par l'IL-12 produit par les cellules dendritiques et les macrophages (Gazzinelli et al., 1994). L'IFN-g permet alors l'activation des fonctions microbicides des macrophages (Scharton-Kersten et al., 1997), ainsi que l'induction de la différenciation des cellules T helper en cellules Th1 productrices d'IFN-g.

      Les principaux sites inducteurs de la réponse immunitaire sont, chez la souris, les plaques de Peyer. L'orientation naturelle de l'immunité dans ces organes est de type Th2 (production d'IL-4, IL-5 et IL-10) et Th3 (production de TGF-b) et conduit à un profil cytokinique en faveur de la production d'IgA et de la stimulation de cellules induisant la tolérance orale des antigènes. Lors d'une infection par certains parasites, l'homéostasie est rompue ; le déséquilibre qui se créé entraîne le basculement de la réponse immune vers un profil de type Th1 (production d'IFN-g et d'IL-2) et la production de cytokines inflammatoires.

      Les mécanismes immunitaires non spécifiques conduisent à l'activation des lymphocytes et vont déclencher ainsi la mise en place de l'immunité spécifique.


Caractérisation de la réponse immune spécifique


Réponse humorale

      La réponse humorale sérique induite par une infection par les Eimeria se caractérise par la production d'anticorps spécifiques de type IgM, IgA et IgG. L'apparition des IgM et des IgA précède celle des IgG mais ne persiste pas. Les IgG sont détectées plus tardivement et leur production est maximale deux à trois semaines après l'infection (Rose et Mockett, 1983 ; Trees et al., 1985). Après une réinfection, seule la production d'IgG augmente à nouveau et plus rapidement (Rose et Mockett, 1983 ; Wakelin et Rose, 1990).

      Dans la muqueuse intestinale, la production d'IgM, d'IgA, et dans certains cas d'IgG, a pu être détectée (Rose et Mockett, 1983 ; Mockett et Rose, 1986 ; Rothwell et al., 1995 ; Girard et al., 1997). Des techniques de détection in situ ont montré que les lymphocytes B de la lamina propria porteurs de l'isotype IgA viennent se concentrer au sommet des villosités, directement au contact des cellules infectées (Nash et Speer, 1988). Les lymphocytes porteurs de l'isotype IgG restent localisés dans la partie basale de la muqueuse.

      In vitro, les anticorps peuvent inhiber la pénétration des stades invasifs du parasite dans les cellules hôtes. Ainsi, les contenus cæcaux riches en IgA, issus d'animaux en cours d'infection par E. tenella, sont capables d'inhiber l'invasion des cellules en culture par des sporozoïtes (Davis et al., 1978 ; Davis et Porter, 1979). De même, des anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes parasitaires peuvent inhiber la pénétration (Crane et al., 1988 ; Ouarzane et al., 1995). Des sérums provenant de poulets immuns sont aussi capables d'augmenter la phagocytose des sporozoïtes et des mérozoïtes par les macrophages (Bekhti et Pery, 1989).

      Cependant, in vivo le rôle joué par les anticorps dans la protection reste controversé. En effet, la bursectomie chez le poulet ne supprime pas la résistance des animaux (Rose et Long, 1970 ; Lillehoj, 1987) et rares sont les cas où le transfert passif d'anticorps protège les animaux de la coccidiose (Rose, 1971 ; Wallach et al., 1994). De même, la déficience de souris en lymphocytes B semble sans implication sur le déroulement de l'infection et l'acquisition de l'immunité (Kitamura et al., 1991).


Réponse immune cellulaire

      Les mécanismes de protection contre une infection parasitaire passent par une action synergique des deux sous-populations lymphocytaires T CD4+ et T CD8+. Les lymphocytes CD4+ reconnaissent l'antigène associé aux molécules de classe II du CMH alors que les lymphocytes CD8+ reconnaissent l'antigène associé aux molécules de classe I du CMH. Dans le modèle murin, les lymphocytes CD4+, ou T helper (Th), en fonction du type de cytokines qu'ils produisent au cours d'une infection, vont orienter la réponse vers i/ soit l'immunité à médiation humorale (production de cytokines de type Th2 : IL-4, IL-5 et IL-10) et l'activation des lymphocytes B ii/ soit l'immunité à médiation cellulaire (production de cytokines de type Th1 : IFN-g et IL-2) et l'activation des fonctions cytotoxiques des macrophages et des lymphocytes CD8+. Le rôle joué par l'immunité à médiation cellulaire dans l'acquisition de la résistance aux infections par les Eimeria a été bien étudié dans le modèle murin et chez le poulet.


Réponse cellulaire systémique

      Les expériences réalisées sur des souris athymiques ont montré une exacerbation de l'infection primaire et une incapacité des animaux à développer une immunité protectrice contre une infection d'épreuve (Rose, 1987). Les poulets thymectomisés, en revanche, ne présentent que très rarement une sensibilité accrue à l'infection ; cependant, la thymectomie totale est difficile à réaliser chez ces animaux (Pierce et Long, 1965 ; Rose et Long, 1970). Dans ce cas, l'utilisation de traitements immunosupresseurs supprimant l'immunité à médiation cellulaire, a démontré son importance au cours de l'infection primaire et dans l'acquisition de la résistance (Long et Rose, 1970 ; Lillehoj, 1987 ; Isobe et Lillehoj, 1993). Ainsi, la cyclosporine A administrée avant l'infection primaire augmente la sensibilité des poulets et, administrée avant la réinfection, supprime la protection (Lillehoj, 1987).

      La réponse proliférative spécifique des lymphocytes T isolés d'animaux préalablement infectés suggère également un rôle joué par ces cellules dans l'acquisition de l'immunité (Rose et Long, 1970 ; Rose et Hesketh, 1984a ; Lillehoj, 1986 ; Martin et al., 1993 ; Wakelin et al., 1993 ; Martin et al., 1995).

      Chez la souris infectée par E. vermiformis, des transferts de cellules de rate et de ganglions mésentériques issues d'animaux immuns, à des animaux sensibles, confèrent une protection (Rose et al., 1988b) ; l'efficacité du transfert est supérieure avec les cellules de ganglions mésentériques. La déplétion des cellules transférées en lymphocytes T CD4+ ne permet plus d'obtenir cette protection alors que la déplétion en lymphocytes T CD8+ est sans effet (Rose et al., 1988a). Dans ce même modèle, des expériences de déplétion in vivo des différentes sous-populations lymphocytaires par injection massive d'anticorps spécifiques ont démontré le rôle majeur des lymphocytes CD4+ au cours de l'infection primaire et, dans une moindre mesure, la participation des lymphocytes CD8+ dans la résistance à la réinfection (Rose et al., 1992). Des travaux plus récents d'inoculation d'E. vermiformis à des souris déficientes pour certains gènes impliqués dans l'immunité ont montré l'importance des lymphocytes T TCRab à la fois au cours de la primo-infection et de la réinfection. Toutefois, les mécanismes mis en jeu au cours de l'infection primaire sont mieux appréhendés : la résistance à la primo-infection est restreinte par les molécules de classe II du CMH et dépend de la production d'IFN-g, ce qui suggére un rôle des lymphocytes CD4+ impliqués dans une réponse de type Th1. En revanche, la résistance à la réinfection n'est pas restreinte par les molécules de classe I ou de classe II du CMH, et ne dépend ni des lymphocytes Tgd ni de la production d'IFN-g, d'IL-4, d'IL-6, de perforine ou de FaS-Ligand (Smith et Hayday, 1998). Il est possible que l'utilisation de souris déficientes pour un seul gène ne permette pas d'élucider les mécanismes mis en jeu du fait de l'implication de plusieurs mécanismes pouvant se compenser mutuellement. Dans d'autres modèles, comme dans le cas d'infection par E. papillata, il a cependant été montré que les cellules NK sont impliquées dans la résistance à l'infection primaire et les lymphocytes CD8+, via un mécanisme cytotoxique perforine dépendant, dans la résistance à l'infection secondaire.

      Chez le poulet, le transfert de cellules spléniques ou de lymphocytes sanguins issus d'animaux immuns protège les animaux sensibles (Rose et Hesketh, 1982). Là aussi, des expériences de déplétion in vivo ont fait apparaître, dans certains cas, un rôle des lymphocytes CD4+ dans la résistance à la primo-infection, et un rôle prédominant des lymphocytes CD8+ et TCRab au cours de la réinfection (Trout et Lillehoj, 1996 ; Lillehoj, 1998).


Immunité cellulaire muqueuse

      Les Eimeria se développant dans les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale, il est vraisemblable que l'immunité locale, qui implique notamment les lymphocytes intra-épithéliaux (LIE) et les lymphocytes de la lamina propria (LPL), joue un rôle essentiel dans la résistance à l'infection. De nombreuses études ont été réalisées concernant la dynamique des différentes populations lymphocytaires de l'intestin au cours de la primo-infection ou de la réinfection.

      Chez les poulets primo-infectés par E. acervulina ou E. tenella, à la fois les LIE CD4+ et CD8+ augmentent à la fin de la période prépatente (Bessay et al., 1996). Dans les cas d'infection par E. maxima, une augmentation du nombre des LIE est observée à la fin de la période prépatente et de la période patente. Cette augmentation concerne à la fois les LPL CD4+ et les LPL et LIE CD8+ (Rothwell et al., 1995). Après réinfection par E. maxima ou E. tenella les lymphocytes CD8+ sont présents en plus grand nombre que les lymphocytes CD4+ dans la muqueuse intestinale (Rothwell et al., 1995 ; Jeurissen et al., 1996 ; Vervelde et al., 1996). Dans les cas d'infection à E. tenella, chez les poulets de lignée résistante, cette augmentation concerne plus particulièrement les LIE CD8+ TCRab suggérant un rôle de ces cellules dans la protection (Lillehoj, 1994). Dix-sept jours après une réinfection par E. acervulina la proportion des LIE CD8+ est encore élevée (Lillehoj et Bacon, 1991).

      Dans le modèle murin une infection par E. papillata provoque une augmentation du nombre de lymphocytes CD8+ TCRab qui reste élevé au cours de la réinfection (Schito et al., 1998). Une infiltration de la lamina propria par ces mêmes cellules est également observée après l'infection primaire et la réinfection par E. vermiformis (Rose et al., 1992).

      L'hétérogénéité des données suivant, le type d'infection (primaire ou secondaire), l'espèce d'Eimeria, l'espèce hôte et la technique employée permet difficilement d'aboutir à un modèle de réponse consensus. Cependant, globalement, il semble se dégager de ces résultats que la sous-population lymphocytaire CD4+ est davantage impliquée dans la résistance à la primo-infection et la sous-population lymphocytaire CD8+ davantage impliquée dans la résistance à la réinfection.


Rôle de l'IFN-g dans la réponse immunitaire

      Dans la plupart des infections parasitaires la réponse Th1, et en particulier la production d'IFN-g, joue un rôle fondamental dans la protection.

      Le rôle de l'IFN-g sur l'inhibition du développement des Eimeria in vitro est connu depuis longtemps (Kogut et Lange, 1989 ; Rose et al., 1991a ; Lillehoj et Choi, 1998). Plus récemment, des études portant sur les mécanismes de cette inhibition ont montré que l'IFN-g pouvait agir sur le développement des parasites en culture en induisant la synthèse de NO par les macrophages activés ou en induisant, dans la cellule hôte, la déplétion du tryptophane intracellulaire (Dimier et al., 1998 ; Dimier-Poisson et al., 1999).

      Les lymphocytes isolés d'animaux infectés produisent davantage d'IFN-g, après stimulation par un mitogène ou des antigènes parasitaires, que les lymphocytes issus d'animaux naïfs (Byrnes et al., 1993 ; Wakelin et al., 1993). Le dosage des ARNm montre également une augmentation du taux de transcription de l'IFN-g au niveau systémique (rate) et local (cæcum) après une infection primaire et secondaire par E. tenella (Yun et al., 2000). Chez les poulets de lignée résistante, cette augmentation de la production d'IFN-g est plus précoce au cours de l'infection primaire et est supprimée, dans le cæcum, par la déplétion des lymphocytes CD4+. Les mêmes résultats ont été obtenus après infection par E. acervulina (Choi et al., 1999) mais dans ce cas il est surprenant qu'il n'y ait pas d'amplification de la transcription d'IFN-g dans le duodénum qui est le site de multiplication du parasite. La résistance à cette espèce parasitaire est corrélée, là aussi, à une augmentation plus précoce du nombre de lymphocytes CD4+ dans l'intestin.

      Le rôle de l'IFN-g a pu être démontré in vivo par injection de doses massives d'un anticorps spécifique. Ces travaux réalisés dans un premier temps chez la souris, ont montré l'importance de l'IFN-g dans la résistance à l'infection primaire (Rose et al., 1989 et 1991b). En effet, après déplétion de cette cytokine, la production d'oocystes, la mortalité et la période patente sont fortement augmentées lors d'une infection par E. vermiformis (Rose et al., 1989). En revanche, le traitement n'empêche pas l'acquisition de l'immunité au cours de l'infection primaire et ne supprime pas la résistance au cours de l'infection d'épreuve. Le rôle de l'IFN-g dans l'infection primaire à E. vermiformis et E. papillata a également pu être démontré chez des souris déficientes pour le gène correspondant (Schito et Barta, 1997 ; Smith et Hayday, 1998). Il faut noter que, suivant les espèces parasitaires et les lignées de souris utilisées, les résultats ne sont pas toujours aussi clairs dans la démonstration du rôle de l'IFN-g ; ainsi la déplétion de cette cytokine semble sans effet dans les cas d'infection par E. pragensis (Rose et al., 1991b).

      Plus récemment, le gène de l'IFN-g de poulet a été cloné (Digby et Lowenthal, 1995). In vivo, le traitement par la cytokine recombinante ou l'injection par voie intramusculaire de cellules exprimant cette cytokine augmente la résistance des poulets à une infection expérimentale par des Eimeria, tant en terme de gain de poids que de réduction de l'excrétion d'oocystes (Lowenthal et al., 1997 ; Lillehoj et Choi, 1998).

      Le type de cellules productrices d'IFN-g semble dépendre de l'espèce animale et de l'espèce parasitaire étudiées. Ainsi, dans les cas d'infection à E. vermiformis, les cellules productrices d'IFN-g sont de type TCRab et expriment des molécules de classe II du CMH  ; il pourrait s'agir de lymphocytes CD4+ de type Th1 (Smith et Hayday, 1998). De même, dans les cas d'infection à E. tenella, la déplétion des lymphocytes CD4+ et non celle des CD8+ supprime la sécrétion d'IFN-g (Yun et al., 2000). En revanche, après infection primaire par E. papillata, les mécanismes de résistance dépendants de l'IFN-g sont liés à la présence des cellules NK (Schito et Barta, 1997). Cette cytokine n'intervient pas dans la résistance à la réinfection mais l'immunité protectrice serait liée à l'activité cytotoxique, perforine-dépendante, des lymphocytes CD8+.

      Dans d'autres modèles d'infection parasitaire, le rôle de l'IFN-g a également été largement démontré. Ainsi, dans le cas d'infection par T. gondii les LIE de type CD8+ TCRab sont impliqués dans la protection par l'intermédiaire d'un mécanisme IFN-g dépendant. Les lymphocytes CD8+ ne sont cependant pas les cellules productrices de cette cytokine (Lepage et al., 1998). La production d'IFN-g serait assurée par les cellules CD4+ de la lamina propria (Liesenfeld et al., 1996 ; Gazzinelli et al., 1996a) ou les cellules NK.


Dualité fonctionnelle des lymphocytes CD8+ dans les infections par les Eimeria : les lymphocytes CD8+, cellules hôtes et cellules anti-parasitaires

      Les travaux décrits chez le poulet tendent à prouver l'importance des lymphocytes T CD8+ dans la résistance à la réinfection par les Eimeria. Ceci semble particulièrement vrai dans le cas de l'infection par E. acervulina. En effet, le nombre de lymphocytes CD8+ augmente après l'infection secondaire (Lillehoj et Bacon, 1991) et ces cellules viennent se placer au contact des entérocytes infectés qui pourraient être la cible de l'activité T cytotoxique (Trout et Lillehoj, 1995). De plus, après déplétion in vivo de ces lymphocytes, on constate une exacerbation de l'excrétion après l'infection secondaire (Lillehoj, 1994). Dans ce modèle, le rôle des lymphocytes CD8+ semble donc assez clairement établi.

      D'autres études réalisées également chez le poulet ont montré que les sporozoïtes sont transportés à travers la lamina propria par des LIE, jusqu'aux cellules épithéliales des cryptes dans lesquelles ils se développent (§ A.6.3). Chez les poulets immuns, la pénétration des sporozoïtes dans la muqueuse intestinale est rarement inhibée et augmente même dans le cas d'infections par E. acervulina (Augustine et Danforth, 1986). Les parasites qui pénètrent sont transportés par les LIE dans la lamina propria mais semblent bloqués dans ces cellules et n'atteignent pas les cellules épithéliales des cryptes (Rose et al., 1984b). La caractérisation des lymphocytes transportant le parasite dans le modèle d'infection à E. acervulina a montré qu'il s'agissait majoritairement de lymphocytes CD8+ (Trout et Lillehoj, 1995).

      Ainsi, il existe une réelle dualité dans le rôle des lymphocytes CD8+ qui, d'une part assurent le transport des sporozoïtes au cours de l'infection primaire et, d'autre part, sont responsables de l'acquisition de l'immunité et probablement de l'arrêt du développement parasitaire au cours de l'infection secondaire. Le transport des parasites par les lymphocytes CD8+ expliquerait que la déplétion de ces cellules provoque une diminution de l'excrétion d'oocystes lors de la primo-infection (Lillehoj, 1994).


Régulation de la réponse immune

      La synthèse précoce de cytokines inflammatoires comme l'IFN-g, que ce soit par des mécanismes spécifiques ou non, est un élément essentiel de la protection contre les infections parasitaires. Toutefois, les processus inflammatoires, délétères pour le parasite, le deviennent aussi pour l'hôte s'ils ne sont pas régulés (Liesenfeld et al., 1996). Différents mécanismes de régulation de la réponse immunitaire sont mis en jeu au niveau local et systémique.

      Dans la muqueuse intestinale, les entérocytes responsables du déclenchement de la réponse immune sont également impliqués dans la régulation des processus inflammatoires. En effet, bien que ces cellules épithéliales expriment à leur surface des molécules de classe II du CMH, l'absence d'expression des facteurs de costimulation suggère que leur capacité de présentation de l'antigène est limitée (Barrett et al., 1993). De plus, la majorité des LIE étant CD8+, leur activation n'est donc pas restreinte par les molécules de classe II du CMH. Les entérocytes semblent cependant pouvoir activer une sous-population de lymphocytes CD8+ ; cette population serait constituée de lymphocytes T-suppresseurs impliqués dans la régulation de la réponse immune (Campbell et al., 1999). Les cellules épithéliales peuvent également inhiber la prolifération des LIE et la production de cytokines par ces cellules (Yamamoto et al., 1998).

      Les LIE sont aussi impliqués dans la régulation de la réponse inflammatoire (Kasper et Buzoni-Gatel, 2001). En effet, chez des souris sensibles à la phase aiguë de l'infection par T. gondii, ces lymphocytes activés sont capables de produire de grandes quantités de TGF-b et d'inverser les processus d'hyperinflammation (D. Buzoni-Gatel, communication personnelle). Les LIE TCRab et TCRgd produisent du TGF-b. Cependant, alors que les lymphocytes Tgd ne semblent pas impliqués dans la protection contre E. vermiformis (Rose et al., 1996), des souris déficientes pour ce récepteur présentent une pathologie intestinale et une réaction inflammatoire exacerbée (Roberts et al., 1996).

      L'IL-10 est une cytokine importante dans le maintien de l'homéostasie lors de la réponse à une infection orale (Gazzinelli et al., 1996b ; Suzuki et al., 2000). Le type cellulaire produisant cette cytokine dans l'intestin n'est pas encore déterminé. Cependant, le transfert de LIE issus de souris déficientes pour le gène de l'IL-10 protège les souris sensibles contre une inoculation d'épreuve ; ainsi les LIE ne semblent pas impliqués directement dans la production de cette cytokine (D. Buzoni-Gatel, communication personnelle).

      Des mécanismes systémiques de régulation de la réponse immunitaire sont secondairement mis en place. Ainsi, le NO et les cytokines inflammatoires comme l'IFN-g sont capables d'induire un rétrocontrôle négatif sur la prolifération des lymphocytes spléniques (Candolfi et al., 1994) et sur l'activité macrophagique (Channon et Kasper, 1996).


Recirculation des lymphocytes

      Chez le poulet, le transport des sporozoïtes par les LIE à travers la lamina propria des villosités intestinales a pu être observé. Chez le lapin, la pénétration du sporozoïte a lieu dans la muqueuse duodénale et sa multiplication dans un segment intestinal parfois très éloigné. L'observation en microscopie électronique de sporozoïtes dans des cellules lymphoïdes de la lamina propria du duodénum et plus tard, de l'organe cible, a conduit à penser que le transport des parasites dans l'organisme au cours de la phase invasive pouvait être lié au processus d'écotaxie des lymphocytes.

      Les lymphocytes recirculent en permanence dans l'organisme via la lymphe et le sang. Cette recirculation augmente la probabilité pour le lymphocyte de rencontrer son antigène spécifique et permet au lymphocyte activé (cellule effectrice ou cellule mémoire) de migrer du site d'induction de la réponse immune vers les sites effecteurs correspondants (Fig 8).

      

Fig. 8 : Cycle entéro-entérique des lymphocytes T, des plasmocytes et des cellules dendritiques chez la souris (d'après Arstila et al., 2000). Rouge : Lymphocytes ; Jaune : Cellules dendritiques ; Rouge : veinules post-capillaires.

      La capacité des lymphocytes à retourner vers les tissus impliqués dans la présentation de l'antigène et dans leur activation est connue depuis longtemps. Ainsi, des LIE isolés de l'intestin et injectés par voie intraveineuse ont la capacité de retourner principalement vers l'intestin et le GALT (Schmitz et al., 1988 ; Sydora et al., 1993 ; Buzoni-Gatel et al., 1999).

      La première étape permettant la migration intra-tissulaire des leucocytes est leur adhésion à l'endothélium spécialisé des veinules post-capillaires (HEV pour 'High Endothelial Veinule') du tissu. L'arrangement combinatoire des différentes molécules d'adhésion à la surface des cellules endothéliales spécifiques du tissu doit être complémentaire de celui que présente le leucocyte circulant à sa surface pour permettre son adhésion (Butcher et Picker, 1996). Ainsi, la complémentarité des adressines vasculaires et des récepteurs lymphocytaires du homing rend compte de la spécificité tissulaire des lymphocytes. L'expression de ces molécules d'adhésion dépend de l'état d'activation des cellules. Les chimiokines et les cytokines présentes dans le microenvironnement peuvent ainsi stimuler l'expression du phénotype HEV de l'endothélium et également augmenter l'expression des molécules d'adhésion à la surface des lymphocytes (Duijvestijn et al., 1986 ; Kilshaw et Murant, 1991 ; Haraldsen et al., 1996). Les lymphocytes non-activés et activés expriment donc des molécules de reconnaissance différentes, et alors que les lymphocytes non-activés peuvent migrer vers de nombreux organes lymphoïdes (O'Neill et al., 1992), les lymphocytes activés migrent préférentiellement vers leur site d'activation (Potsch et al., 1999).

      L'extravasation des lymphocytes se fait en plusieurs étapes (Springer, 1995 ; Butcher et Picker, 1996). Ce processus a été particulièrement bien observé in vivo chez le lapin (Lindbom et al., 1990 ; Granert et al., 1994 ; Olofsson et al., 1994). La première étape dans la migration est donc l'adhésion d'un leucocyte circulant à la paroi des HEV. Cette interaction, médiée par des sélectines, est indépendante de l'état d'activation du leucocyte et déclenche le 'rolling' de celui-ci sur la paroi endothéliale. La présence de chimiokines immobilisées à la surface de l'endothélium (Tanaka et al., 1993 ; Baggiolini, 1998) pourrait ensuite servir de signal d'activation au leucocyte et induire l'expression d'intégrines à sa surface. L'interaction de ces intégrines avec les adressines vasculaires provoque l'immobilisation du leucocyte et son adhésion ferme à l'endothélium. Les leucocytes migrent alors entre les cellules endothéliales puis dans le tissu, vraisemblablement le long d'un gradient de chimiokines immobilisées. Plusieurs molécules et mécanismes d'adhésion ont été caractérisés chez le lapin (Winn et Harlan, 1993 ; Talbott et al., 1994 ; Hogg et Doershuck, 1995).

      Les HEV sont présentes dans tous les tissus et organes lymphoïdes secondaires (paracortex des ganglions lymphatiques, zones interfolliculaires du GALT), hormis la rate et la lamina propria. Cependant, les lymphocytes pénètrent dans la rate par la zone marginale et dans la lamina propria par les veinules plates (Jeurissen et al., 1987). Le passage des lymphocytes vers la lamina propria met en jeu un mécanisme atypique d'extravasation. En effet, la fixation des lymphocytes à l'endothélium est indépendante de la L-sélectine (Berlin et al., 1995) mais nécessite l'interaction de la molécule MadCAM-1 (mucosal adressin cell adhesion molecule 1) avec l'intégrine lymphocytaire a4b7 (Jeurissen et al., 1987 ; Streeter et al., 1988 ; Briskin et al., 1997). L'intégrine a4b7 est essentielle au retour des lymphocytes dans la muqueuse intestinale et un traitement des lymphocytes isolés du GALT avec un anticorps anti-a4b7 inhibe le repeuplement de l'épithélium intestinal (Hamann et al., 1994).

      Il existe donc des molécules impliquées spécifiquement dans l'adhésion et la migration des lymphocytes mais également des molécules impliquées dans leur rétention dans les organes lymphoïdes (Campbell et al., 1998 ; Gunn et al., 1998 ; Willimann et al., 1998). La composition du microenvironnement joue un rôle important dans la composition lymphocytaire du tissu. Ainsi, le TGF-b exprimé en fortes quantités dans la muqueuse intestinale active l'expression de l'intégrine aEb7 à la surface des LIE et pourrait jouer un rôle dans la rétention de ces cellules dans l'épithélium.

      Les lymphocytes du GALT stimulés par l'antigène dans un site inducteur entament un cycle entéro-entérocytaire. La plupart de ces lymphocytes expriment alors à leur surface de faibles quantités de L-sélectine couplées à de fortes quantités d'a4b7. Ils migrent par voie lymphatique dans les ganglions mésentériques et rejoignent la circulation sanguine par le canal thoracique (Fig 8, ) ( Butor et al., 1995). L'expression du ligand de l'intégrine a4b7, MadCAM-1, est restreinte aux HEV des ganglions mésentériques et du GALT et aux veinules de la lamina propria permettant ainsi le retour de ces lymphocytes à la muqueuse intestinale (Streeter et al., 1988 ; Butcher et Picker, 1996 ; Briskin et al., 1997 ; Perry et al., 1998).

      Dans les sites inducteurs du GALT sont également observés des lymphocytes exprimant a4b1 (Farstad et al., 1995), intégrine dont le ligand VCAM-1 est exprimé dans les tissus extra-intestinaux, notamment dans les muqueuses bronchique, nasale et utérine (Bentley et al., 1993 ; Jahnsen et al., 1995 ; Perry et al., 1998). Ainsi, les différents compartiments muqueux de l'organisme ne seraient pas totalement cloisonnés. Cependant, des hypothèses contradictoires sont émises à ce sujet dont la synthèse a été faite par Brandtzaeg et al. (1999). En effet, l'expression d'adressines vasculaires comme MadCAM-1 restreinte essentiellement à la muqueuse intestinale laisse penser qu'il existe une dichotomie entre tractus aérodigestif et intestinal. De nombreuses expériences renforcent cette hypothèse. Ainsi, une immunisation par voie nasale chez la souris n'induit qu'une réponse négligeable en terme de production d'IgAs intestinales (Sminia et al., 1989). De plus, de même que les LIE intestinaux activés retournent principalement dans l'intestin, les lymphocytes B activés isolés des amygdales retournent préférentiellement aux poumons (Nadal et al., 1991). La muqueuse du tractus urogénital semble, elle, davantage reliée au NALT puisque l'immunisation par voie nasale induit la production d'immunoglobulines spécifiques dans les sécrétions vaginales (Brandtzaeg, 1997). Cependant, un lien entre la muqueuse rectale ou celle de l'appendice et la muqueuse utérine a également été suggéré, l'immunisation par voie rectale induisant la production d'immunoglobulines dans la muqueuse du tractus génital (Hordnes et al., 1996 ; Brandtzaeg, 1997 ; Crowley-Nowick et al., 1997). L'état actuel des connaissances sur les mécanismes moléculaires ne permet pas de pousser plus avant les conclusions sur la régionalisation et l'interconnexion des différents systèmes lymphoïdes associés aux muqueuses.


Objectifs

      Le développement endogène de plusieurs espèces d'Eimeria a été bien étudié par le laboratoire et a permis de mettre en évidence certaines particularités propres au lapin : la pénétration du sporozoïte a lieu dans la muqueuse duodénale alors que son développement s'effectue dans les cellules épithéliales d'un autre segment de l'intestin, parfois très éloigné du lieu de pénétration. Pour E. coecicola dont le cycle a été bien décrit, le sporozoïte pénètre dans le duodénum et la multiplication se déroule dans le GALT, en particulier dans l'appendice vermiforme. Durant la phase d'invasion, le parasite a été observé dans des cellules lymphoïdes de la lamina propria de ces deux segments intestinaux. La première mérogonie a également lieu dans les cellules lymphoïdes du GALT. Compte-tenu d'une part, de la distance séparant le site de pénétration du site de développement du sporozoïte et du temps nécessaire au trajet, et d'autre part, de l'observation de sporozoïtes dans les cellules lymphoïdes de la lamina propria des deux segments, l'hypothèse d'un transport extra-intestinal du parasite par les lymphocytes, du duodénum jusqu'au site de multiplication spécifique, a été formulée. L'objectif principal de ce travail était la vérification de cette hypothèse. Nous avons donc recherché la présence extra-intestinale du parasite par immunohistochimie et vérifié sa viabilité dans ces organes par réalisation d'un test in vivo. Nous avons également recherché quels types de cellules lymphoïdes hébergent le parasite au cours de la phase invasive et essayé de suivre son trajet migratoire dans l'organisme après radiomarquage.

      Le deuxième volet de notre étude, concernant l'acquisition de l'immunité, a été réalisé avec E. intestinalis. En effet, bien qu'E. coecicola soit un bon modèle pour l'étude de la phase d'invasion par le sporozoïte, cette espèce constitue, de par sa localisation dans le GALT et sa multiplication dans des cellules lymphoïdes, une exception parmi les Eimeria du lapin. Chez la souris, les mécanismes immunitaires mis en jeu peuvent être très différents selon l'espèce. Ainsi, les résultats obtenus avec une espèce parasitaire ne permettent pas de préjuger des mécanismes mis en jeu pour une autre espèce. Dans ce contexte, il semblait plus judicieux de travailler avec une espèce moins particulière qu'E. coecicola. De plus, dans le cadre de la mise au point d'une vaccination, E. intestinalis est très pathogène et constitue une espèce d'intérêt en élevage, contrairement à E. coecicola.

      Des études immunohistologiques ont été réalisées avec E. intestinalis pour comparer le comportement de cette espèce au cours de sa phase invasive avec celui d'E. coecicola, et pour comparer le comportement des parasites chez des animaux naïfs et immunisés. Jusqu'à maintenant très peu de travaux ont été menés sur l'immunité du lapin contre les agents pathogènes qui lui sont spécifiques et aucun concernant l'immunité contre les coccidies. Nous nous sommes intéressés à l'implication de 2 sous-populations lymphocytaires T, CD4+ et CD8+, décrites comme jouant un rôle dans l'acquisition de l'immunité contre les Eimeria chez la souris et le poulet. L'évolution des proportions relatives de ces 2 populations lymphocytaires dans l'intestin, les ganglions mésentériques et la rate au cours des inoculations successives a été analysée par cytométrie en flux. Nous avons ensuite déterminé la cinétique de mise en place de l'immunité mucosale et systémique au cours de la primo-infection par mesure de la prolifération spécifique des lymphocytes des ganglions mésentériques et de la rate et par le dosage des IgG sériques.


Matériel et méthodes


Animaux et conditions d'élevage


Production des animaux EOPS

      Les lapins utilisés provenaient tous de l'élevage de la station de Pathologie Aviaire et de Parasitologie. Ils sont élevés dans des conditions contrôlées et sont Exempts d'Organismes Pathogènes Spécifiés (EOPS), en particulier exempts de coccidies, de pasteurelles et d'Encephalitozoon cuniculi. Le sevrage a lieu à 28 jours. Les animaux sont nourris avec de l'aliment supplémenté en Robénidine (UAR, 91360 Villemoison/Orge, France).

      Deux colonies de lapins EOPS sont disponibles :

      des lapins standard de race Néo-Zélandaise blanche (souche INRA 1077) utilisés principalement pour la multiplication des souches d'Eimeria ;

      des lapins homozygotes sur des gènes du CMH, issus de la colonie précédente :

      Pour obtenir ces animaux, le polymorphisme de 2 gènes de classe II du CMH, les gènes DQa et DRa, a été testé par RFLP. Six allèles différents ont été trouvés pour le gène DQa et 4 pour le gène DRa. Les animaux homozygotes pour ces 2 gènes ont été multipliés entre eux depuis 1993 soit 8 à 10 générations et nous disposons actuellement de 2 lignées homozygotes pour DQa/DRa, les lignées EE/BB et GG/CC. Nous avons utilisé ces lapins pour les expérimentations mettant en jeu des transferts de cellules ou concernant la réaction immunitaire.


Conditions expérimentales

      Quatre jours avant d'être transférés de l'élevage vers les salles d'expérimentation où ils sont inoculés, les lapins reçoivent un aliment non supplémenté en Robénidine. Les salles d'expérimentation sont en surpression, l'air y est filtré et des précautions d'accès sont prises afin d'éviter les contaminations par des agents pathogènes provenant du milieu extérieur. Entre chaque expérimentation les salles sont nettoyées, passées à la vapeur d'eau (120°C) sous pression et désinfectées au formol.

      Pour les inoculations nécessitant une intervention chirurgicale, les animaux ont été opérés au laboratoire. Dans certaines expérimentations, afin d'éviter toute contamination par le milieu environnant, les lapins ont été placés dans des microisolateurs autoclavés puis transférés en salle d'expérimentation pour les collectes de fèces.


Parasites

      Les différentes souches parasitaires actuellement disponibles au laboratoire ont été obtenues à partir de prélèvements de fèces provenant de différents élevages français et étrangers. Pour obtenir des souches pures de chaque espèce d'Eimeria, des multiplications in vivo ont été réalisées en inoculant des animaux chacun avec un seul oocyste isolé dans de la gélose.


Entretien des souches - Multiplication des Eimeria

      Les différentes espèces d'Eimeria sont entretenues par multiplication in vivo. Les lapins sont inoculés per os à l'âge de 5 à 7 semaines avec des oocystes sporulés. Les quantités d'oocystes inoculées dépendent du pouvoir de multiplication et du pouvoir pathogène de l'espèce d'Eimeria. Les doses utilisées doivent permettre d'obtenir la production maximale d'oocystes (1 à 50 x 108 oocystes excrétés en fonction de l'espèce parasitaire) sans provoquer la mort de l'animal. Le maximum d'excrétion est obtenu avec un inoculum d'au moins 400 oocystes pour E. coecicola et d'au moins 1000 oocystes pour E. intestinalis, sans dépasser 2500 oocystes pour cette espèce très pathogène.

      Les animaux sont sacrifiés 1 jour avant le pic d'excrétion parasitaire. Dans ces conditions la plupart des oocystes se trouvent dans le caecum et peuvent être purifiés à partir de son contenu.


Obtention des différentes formes parasitaires


Obtention des oocystes


A partir du contenu caecal - Extraction de souche

      Les caecums sont prélevés le jour précédant le pic d'excrétion parasitaire. La première étape de purification des oocystes consiste à éliminer les plus gros débris végétaux par filtration du contenu caecal sur des tamis de maillages décroissants (450, 100 et 50 µm). Le dernier filtrat est centrifugé (1200 g, 10 min) et le culot remis en suspension dans de l'eau de Javel (45° chlorométriques, diluée à 20% dans de l'eau) à une température de 4°C. Les particules organiques et les micro-organismes sont ainsi éliminés. Après plusieurs rinçages à l'eau, une flottation est réalisée en déposant 1 volume de suspension d'oocystes sur 3 volumes d'une solution saturée de chlorure de sodium (densité = 1,2). Une centrifugation pendant 3 min à 900 g permet de séparer les oocystes, situés à l'interface eau/NaCl, des débris végétaux. Les oocystes sont ensuite rincés à l'eau, comptés avec une cellule de Thoma et remis en suspension à une concentration de 106/ml dans une solution de bichromate de potassium à 5%. La suspension est mise à sporuler au bain-marie agité à 26°C (60 heures pour E. intestinalis et E. coecicola). Une fois sporulés les oocystes sont conservés à 4°C pendant plusieurs mois.


In situ - A partir de l'appendice vermiforme

      Certaines expérimentations ont été réalisées dans le but de marquer in vivo les sporozoïtes d'E. coecicola à l'uracile tritiée. Le parasite se multipliant dans le GALT la radioactivité a été injectée in situ dans l'appendice vermiforme. Dans ces conditions radioactives, il convenait de trouver une technique permettant d'obtenir les oocystes dans le plus petit volume possible pour limiter la production de déchets radioactifs liquides. Nous avons mis au point un système permettant la récupération des oocystes dès leur libération dans la lumière intestinale. Ce dispositif consiste en un réservoir en latex abouché à l'extrémité distale de l'appendice vermiforme par l'intermédiaire d'un cathéter en caoutchouc souple (Fig. 9). Une ligature assez lâche est pratiquée à l'extrémité caecale de l'appendice pour éviter une fuite de la radioactivité et des oocystes libérés vers le caecum. Le dispositif est mis en place lors d'une intervention chirurgicale pratiquée entre le sixième et le huitième jour post-inoculation. La libération des oocystes dans la lumière de l'appendice débute le neuvième jour. Les animaux sont sacrifiés le dixième ou le onzième jour et l'appendice et le réservoir en latex sont récupérés pour extraire les oocystes. Le contenu liquide du réservoir est filtré sur toile de nylon de porosité 150 µm pour éliminer une partie du mucus. Les oocystes sont ensuite rincés plusieurs fois à l'eau puis mis en suspension dans une solution de bichromate de potassium à 5% et mis à sporuler au bain-marie agité à 26°C.

      

Fig. 9 : Dispositif de récupération des oocystes d'E. coecicola in situ dans l'appendice vermiforme.


Obtention des sporocystes

      Les oocystes sont rincés à l'eau afin d'éliminer le bichromate de potassium puis repris dans du tampon PBS. Après centrifugation, les culots d'oocystes sont broyés par agitation au 'vortex' en présence de billes de verre de 1 mm de diamètre. La libération des sporocystes est contrôlée au microscope. Les billes de verre sont rincées avec du tampon PBS, les sporocystes sont comptés avec une cellule de Thoma puis centrifugés à 400 g avant d'être remis en suspension à la concentration adéquate.


Obtention des sporozoïtes

      La libération des sporozoïtes à partir des sporocystes se fait en 2 à 3 min sous l'action du milieu d'excystation à 37°C (annexe 1). La réaction est arrêtée par ajout de tampon PBS froid (4°C). Après centrifugation (400 g, 10 min, 4°C), les sporozoïtes sont repris dans du tampon PBS.


Préparation d'extraits d'oocystes

      Les oocystes purifiés et lavés sont mis en suspension dans du tampon PBS. Après centrifugation, le culot d'oocystes est broyé par agitation au 'vortex' avec des billes de verre de 3 mm de diamètre jusqu'à ce qu'on n'observe plus d'oocystes ni de sporocystes. Les sporozoïtes et les débris restants sont ensuite totalement détruits aux ultrasons. La solution obtenue est centrifugée 10 min à 10000 g et 4°C. Le surnageant est filtré à 0,22 µm pour stériliser la préparation. La quantité de protéines solubles présentes dans la solution antigénique est déterminée par la technique de l'acide bicinchoninique (kit BCA, Pierce Rockford, IL, USA). La préparation est ensuite stockée à -20°C avant d'être utilisée pour les tests ELISA ou les tests de prolifération lymphocytaire.


Infections expérimentales

      En fonction de l'objectif expérimental les animaux ont été inoculés avec différents stades parasitaires et par différentes voies.


Inoculation per os

      La voie orale est la voie d'infection naturelle. Les inoculations pour les multiplications de souches d'Eimeria, les immunisations d'animaux et les protocoles consistant à étudier l'immunité lors de la primo-infection chez le lapin, ont donc été réalisés selon cette modalité. Des volumes de 200 µl de suspension d'oocystes sporulés sont inoculés per os avec une micropipette.


Inoculation intraduodénale de sporocystes

      Cette voie d'inoculation a été utilisée pour l'étude du cycle parasitaire d'Eimeria coecicola. Dans ce cas, l'excystation et la pénétration des sporozoïtes se font dans les minutes suivant l'injection des sporocystes dans le duodénum. Comparée à la voie d'inoculation per os où les sporocystes arrivent progressivement dans l'intestin, la voie d'inoculation intraduodénale permet de synchroniser le développement des parasites.

      Pour injecter les parasites dans le duodénum, une intervention chirurgicale est nécessaire. Les lapins reçoivent 1 ml de Nozinan 25 mg/ml en prémédication puis sont endormis par injection intraveineuse de kétamine (Imalgène 500). Les sporocystes ou sporozoïtes sont injectés dans le duodénum sous un volume maximum de 1 ml.


Injection ex situ de sporozoïtes

      Des essais d'inoculation ex situ ont été réalisés par injection de sporozoïtes. Des inoculations dans des sites intestinaux non spécifiques de l'espèce (côlon et rectum pour E. coecicola) et par différentes voies, intraveineuse (IV, injection dans la veine marginale de l'oreille), intramusculaire (IM, injection dans le râble), intra-péritonéale (IP), intra-splénique et intra-utérine ont été réalisées.


Mesure de l'excrétion parasitaire (Coudert et al., 1995)

      La période prépatente pour E. coecicola et E. intestinalis est de 9 jours. Le 6ème jour post-inoculation, un contrôle est effectué sur les excréta pour vérifier l'absence de contamination, en particulier par E. media et E. magna. Les récoltes sont ensuite, soit globales du 7ème au 12ème jour, soit quotidiennes, notamment dans les expériences de transfert de cellules infectées, pour détecter le début de l'excrétion. Le nombre d'oocystes excrétés est calculé de la manière suivante : 300 g d'excréta maximum sont réhydratés avec 5 fois leur poids en eau puis homogénéisés au mixeur. Deux prélèvements de 40 g sont effectués. Un des 2 échantillons est tamisé à 500 µm et dilué avec du sulfate de magnésium (densité = 1,2) et le volume ajusté à 100 ml. Après une bonne agitation de la suspension, les oocystes sont comptés avec une cellule de Mac Master modifiée (20 colonnes pour 1 cm2). Si la concentration des coccidies est trop importante, des dilutions successives dans du sulfate de magnésium sont effectuées. Le nombre total d'oocystes excrétés par animal se calcule de la façon suivante :

      

      N = nombre d'oocystes présents dans une chambre de la cellules de Mac Master (20 colonnes)

      D = Facteur de dilution éventuelle de la solution de 100 ml

      P = Poids total des excréta de la cage

      a = nombre d'animaux dans la cage


Obtention de suspensions cellulaires a partir de différents organes et tissus

      Des suspensions de cellules totales ou de leucocytes ont été préparées à partir d'organes ou de tissus et ont été utilisées dans plusieurs protocoles consistant soit à étudier le cycle parasitaire des Eimeria, soit la réponse immune du lapin. Dans tous les cas, que les cellules soient destinées à être injectées à des lapins receveurs, marquées pour analyse en cytométrie en flux ou mises en culture, la technique de préparation reste la même.


Sang et leucocytes sanguins

      Dix millilitres de sang sont prélevés à la veine centrale de l'oreille dans des tubes contenant une solution d'EDTA-K3. Après centrifugation 15 min à 2000 g et à 4°C, les leucocytes sanguins (ou PBL) sont prélevés à l'interface hématies/plasma à l'aide d'une pipette Pasteur, transférés dans des tubes de 50 ml dans du milieu RPMI-1640 (Sigma, St Louis, MO) contenant 2% de sérum de veau foetal (SVF, Sigma) et centrifugés à nouveau pendant 10 min à 400 g. Le culot est remis en suspension dans une solution de chlorure d'ammonium (annexe 1) pour éliminer les globules rouges restants par choc hypotonique. La lyse est arrêtée après 2 min avec du milieu RPMI/SVF 2%. Après centrifugation (10 min, 400 g), les leucocytes sont remis en suspension en milieu RPMI/SVF 2% et comptés dans une cellule de Thoma.


Leucocytes de la rate, du ganglion mésentérique et de l'appendice vermiforme

      Les animaux sont saignés après étourdissement, puis les différents organes prélevés. L'appendice vermiforme est ouvert longitudinalement et rincé avec du tampon. Les organes sont écrasés sur des grilles métalliques à l'aide d'un piston de seringue dans du milieu RPMI/SVF 2%. Les suspensions cellulaires obtenues sont centrifugées 10 min à 400 g. Pour la rate, une étape de lyse des hématies est nécessaire. Le culot est repris dans une solution de chlorure d'ammonium (annexe1) pendant 2 min. Après ajout de milieu et centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans du milieu RPMI/SVF 2% et comptées dans une cellule de Thoma. Un test au bleu Trypan permet d'estimer la viabilité cellulaire.


Cellules totales de l'intestin

      Le duodénum et l'iléon sont prélevés en totalité et le contenu intestinal éliminé par rinçage avec du PBS. L'intestin est ouvert longitudinalement et coupé en morceaux puis les plaques de Peyer sont enlevées. La muqueuse intestinale est grattée à l'aide d'un scalpel puis dissociée par agitation magnétique douce dans du milieu RPMI/SVF 10% contenant 1 mM de dithioerythritol (Sigma). Le dithioerythritol permet la réduction des ponts disulfure et favorise ainsi la dissociation des cellules. Après plusieurs lavages et centrifugations 10 min à 400 g, les débris tissulaires et agrégats cellulaires sont éliminés par une centrifugation lente (40 g). Le surnageant est alors prélevé, centrifugé et remis en suspension dans du milieu RPMI/SVF 2%. Les cellules sont comptées dans une cellule de Thoma.


marquages immunologiques et analyse de la fluorescence

      Deux types de marquage immunologique ont été réalisés, des marquages immunohistochimiques et des marquages de cellules en suspension. Dans tous les cas il s'agissait de marquages par immunofluorescence indirecte, l'analyse étant réalisée au microscope à fluorescence ou au cytomètre en flux.


Marquages immunohistochimiques

      Les marquages sur lames ont été réalisés essentiellement sur des coupes de tissus, pour rechercher la présence des sporozoïtes dans divers organes et tissus et pour observer la répartition des lymphocytes dans l'intestin au cours de l'infection.


Préparation des lames histologiques


Sporozoïtes libres séchés sur lames

      Pour tester la qualité et la spécificité des anticorps dirigés contre E. coecicola ou E. intestinalis des essais sont réalisés sur des sporozoïtes séchés sur lames. Après excystation, les sporozoïtes sont filtrés sur une colonne de coton pour éliminer les oocystes et les coques d'oocystes vides et la concentration est ajustée à 106 sporozoïtes/ml. Dix µl/cupule sont déposés sur des lames à puits. Les lames sont séchées dans un courant d'air frais puis conservées à -20°C.


Coupes de tissus infectés

Prélèvement des organes

      Les animaux sont sacrifiés à différents temps post-inoculation et les organes sont rapidement prélevés. Des échantillons sont enveloppés dans du papier d'aluminium huilé et congelés sur de la carboglace puis conservés à -80°C.


Réalisation des coupes et fixation

      Les prélèvements congelés sont enrobés dans un liquide cryoprotecteur (cryomatrix, Shandon, Pittsburgh, PA) permettant de fixer les blocs sur le porte-objet du cryostat. Les coupes de 7 à 8 µm d'épaisseur sont déposées sur des lames dégraissées (SuperFrost®Plus, Menzel-Glaser, Allemagne) et fixées à l'acétone à -20°C pendant 20 min. Les lames sont ensuite séchées à l'air libre et peuvent être congelées à -20°C en attendant d'être marquées.


Anticorps utilisés et technique de marquage en immunofluorescence indirecte


Anticorps anti-sporozoïtes

Anticorps monoclonaux de souris

      Les anticorps monoclonaux sont produits par des hybridomes de souris. Ces hybridomes résultent de la fusion d'une cellule splénique de souris immune (cellule sécrétrice d'immunoglobuline incapable de se multiplier) et d'une cellule de myélome (cellule non sécrétoire mais à fort taux de multiplication). Les cellules des clones ont la double capacité de se multiplier et de sécréter un type d'immunoglobuline spécifique d'un antigène donné.

      Les souris ont été immunisées avec des sporozoïtes injectés par voie intra-péritonéale. Les clones obtenus ont été testés par immunofluorescence indirecte sur des sporozoïtes. Les anticorps monoclonaux dirigés, soit contre E. intestinalis, soit contre E. coecicola, étaient disponibles à mon arrivée au laboratoire.


Anticorps polyclonaux de poulet

      Pour obtenir de grandes quantités d'anticorps spécifiques d'Eimeria coecicola et d'Eimeria intestinalis nous avons immunisé des poules avec des sporozoïtes des 2 espèces et extrait les anticorps à partir des oeufs. Le choix d'immuniser des poules présentait 2 avantages :

      nous fournir facilement une grande quantité d'anticorps

      nous fournir des anticorps produits sur une espèce éloignée de celles sur lesquelles sont produits la plupart des anticorps du commerce (avec l'objectif de réaliser des doubles marquages)

      Les poules ont été immunisées par voie sous-cutanée, 3 fois à 15 jours d'intervalle, avec une préparation contenant 106 sporozoïtes d'E. coecicola, autant de sporozoïtes d'E. intestinalis, et de l'adjuvant de Freund complet, à la 1ère injection, puis incomplet, aux 2ème et 3ème injections. L'extraction des immunoglobulines a été réalisée à partir des oeufs pondus du 15ème au 21ème jour suivant le 2ème rappel. Le protocole décrit est celui de Polson et Von Wechmar (1980). A un volume de jaune d'oeuf sont ajoutés 4 volumes de tampon PBS et 3,5% (P/V final) de polyéthylène glycol 6000 (PEG). Après dissolution du PEG, la préparation est centrifugée 10 min à 5000 g. Le surnageant est filtré sur une colonne de coton et aux filtrats obtenus sont ajoutés 8,5% de PEG (P/V). Après une nouvelle centrifugation (10 min, 5000 g), le culot est repris dans du tampon PBS et congelé. Les anticorps ont été testés sur des sporozoïtes par immunofluorescence indirecte.


Anticorps anti-lymphocytes

      Les anticorps anti-lymphocytes sont des anticorps monoclonaux du commerce. En immunohistochimie, seuls les anticorps anti-CD5 et anti-CD8 (MCA800 et MCA1576, Serotec Ltd, Oxford, GB) se sont révélés assez puissants pour qu'un marquage puisse être observé au microscope à fluorescence.

      Au début de notre étude, nous ne disposions pas d'anticorps dirigés contre le récepteur CD3 des lymphocytes T. Nous avons donc utilisé les anticorps du commerce produits par le clone Ken-5 et fournis comme anti-CD5 (Kotani et al., 1993). Le récepteur CD5 est censé être présent à la surface de tous les lymphocytes T mais également de certains lymphocytes B périphériques. Le clonage du récepteur CD5 du lapin, et le développement d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine recombinante (Raman et Knight, 1992), ont montré que ces anticorps reconnaissent la majorité des lymphocytes B, ce qui n'est pas le cas des anticorps produits par le clone Ken-5. Les anticorps MCA800 ne reconnaissent donc pas le récepteur CD5 mais une molécule présente uniquement à la surface des lymphocytes T (Knight et Lanning, 1998). Aussi, par la désignation CD5+ qui persiste dans quelques figures de notre étude il faudra comprendre lymphocytes pan-T.


Réalisation du marquage

      Les lames fixées à l'acétone sont saturées pendant 15 min dans du tampon Mayer/BSA à 5% (P/V). L'anticorps primaire est ensuite déposé à la concentration adéquate (Tab. 5) et les lames sont mises à incuber la nuit à 4°C en chambre humide. Après 3 lavages en tampon Mayer, on réalise une incubation d'1 heure à l'obscurité, à température ambiante, avec les anticorps secondaires couplés à la fluorescéine. Les dilutions utilisées sont données dans le tableau 5. Après 3 nouveaux lavages les coupes sont contre-colorées au bleu Evans pendant 5 min, rincées avec du tampon Mayer et montées en milieu aqueux Mayer/Glycérol 20%.

      

Tab. 5 : Dilutions des différents anticorps pour le marquage immunohistochimique en immunofluorescence indirecte. ACm = anticorps monoclonaux anti-sporozoïtes ou anti-lymphocytes ; GAM-FITC = Goat anti Mouse - FITC ; GACH-FITC = Goat anti Chicken - FITC


Observation des lames - Estimation du nombre de parasites

      Au microscope à fluorescence, le marquage apparaît en vert sur fond rouge. En effet, la contre-coloration au bleu Evans donne une coloration rouge aux tissus non marqués environnants, en lumière UV.

      Le nombre moyen de parasites par coupe est estimé par dénombrement sur 10 coupes.


Marquage, analyse et tri des lymphocytes en suspension

      Les cellules en suspension sont préparées selon la technique déjà décrite dans le chapitre C. Les lymphocytes ont été marqués pour étudier la cinétique de répartition des différentes populations lymphocytaires au cours de l'infection, et pour déterminer ceux susceptibles d'être infectés par le parasite.


Anticorps utilisés


Anticorps primaires

      Les anticorps utilisés sont ceux du commerce. Pour les lymphocytes T, 3 anticorps monoclonaux, produits sur souris, sont disponibles : les anticorps anti-CD5 (pan-T), anti-CD4 et anti-CD8 (respectivement MCA800, MCA799 et MCA1576, Serotec). Pour les lymphocytes B nous ne disposons pas d'anticorps monoclonaux donnant un marquage suffisant ; nous utilisons donc des anticorps polyclonaux anti-IgM ou anti-Ig totales, produits sur chèvre (respectivement GAR/IgM(Fc) et GAR/Ig, Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, NL).


Anticorps secondaires - Conjugués

      Les anticorps secondaires utilisés sont couplés à des fluorochromes, soit la fluorescéine (FITC), soit la phycoérythrine rouge (R-PE). Les conjugués utilisés pour révéler les anticorps monoclonaux de souris sont produits sur chèvre. Le conjugué révélant les anticorps primaires de chèvre est produit sur âne.

      Les dilutions de tous les anticorps primaires et secondaires pour l'utilisation en cytométrie en flux sont données dans le tableau 6.

      Pour chaque marquage, l'absence de fixation non spécifique des conjugués est testée en remplaçant l'anticorps primaire par du milieu RPMI/SVF 2%.

      

Tab. 6 : Dilutions des différents anticorps pour le marquage en immunofluorescence indirecte et analyse en cytométrie en flux. ACm = Anticorps monoclonaux MCA800, MCA799 et MCA1576 ; GAR/IgM = Goat anti-Rabbit IgM(Fc) (Nordic) ; GAR/Ig = Goat anti-Rabbit Ig (Nordic) ; GAM-FITC = Goat Anti-Mouse IgG (H+L)-FITC (M30001,CALTAG Laboratories, Burlingame, CA) ; GAM-PE = Goat Anti-Mouse IgG (H+L) F(ab')2-PE (115-106-146, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) ; DoAG-FITC = Donkey Anti-Goat- FITC (Nordic)


Technique de simple marquage par immunofluorescence indirecte

      Les cellules sont réparties dans des tubes de 1,5 ml à raison de 2x106 cellules par tube. Après centrifugation (8 min, 400 g, 4°C), le culot cellulaire est remis en suspension avec l'anticorps primaire à la concentration adéquate et dans un volume d'au moins 100 µl. Après 1 heure d'incubation à 0°C, 2 lavages successifs avec 800 µl de milieu RPMI/SVF 2% permettent d'éliminer l'anticorps en excès. Les cellules sont remises en suspension avec le conjugué pendant 1 heure à 0°C. Après 2 lavages, les cellules peuvent être soit directement analysées au cytomètre en flux, soit remises en suspension dans une solution de paraformaldéhyde 1% et conservées à 4°C à l'obscurité pendant 2 à 3 jours jusqu'à l'analyse.


Technique de double marquage par immunofluorescence indirecte

      Le double marquage était nécessaire dans nos expériences de tri cellulaire pour séparer de façon optimale les lymphocytes simplement marqués CD5+, des lymphocytes simplement marqués IgM+, puisque dans la littérature certains lymphocytes B sont décrits comme étant également CD5+. Le double marquage était le moyen pour nous d'éliminer cette éventuelle population de lymphocytes doublement marqués et d'obtenir des lymphocytes CD5+ d'une part, et IgM+ d'autre part. A posteriori, l'anticorps MCA800 ne reconnaissant pas le récepteur CD5, mais un récepteur présent uniquement à la surface des lymphocytes T, la précaution du double marquage n'était pas indispensable. La technique comporte 2 étapes successives de simple marquage, avec 2 anticorps primaires différents, révélés par 2 conjugués couplés à des fluorochromes différents.

      Pour notre étude, la première étape consiste à marquer les lymphocytes B avec l'anticorps GAR/IgM(Fc) puis le conjugué DoAG-FITC, la deuxième, à marquer les lymphocytes T. Les cellules sont incubées avec l'anticorps anti-CD5 ; la révélation se fait avec un conjugué GAM couplé à la phycoérythrine rouge. Après lavage, les cellules sont directement analysées au cytomètre en flux avant d'être triées.


Analyse en cytométrie en flux


Principe de fonctionnement du cytomètre utilisé (Fig. 10)

      L'appareil utilisé est un analyseur trieur de cellules FACStar®Plus de la société Becton-Dickinson (San-José, USA). Le logiciel d'analyse utilisé est le LysysäII, développé par cette même société.

      Les cellules en suspension sont dirigées sous une pression d'azote de 1 à 2 bars (selon la concentration de la suspension cellulaire) vers la cellule d'écoulement où elles sont entourées d'une veine liquide. Elles passent ensuite devant la source lumineuse, un laser argon RPC 50, de puissance d'utilisation 80 mW, fourni par la Société ILT (Salt Lake City, USA). Il émet à 488 nm et est refroidi par air. La vitesse moyenne de passage devant le laser est de l'ordre de 60 km/h ; ainsi les cellules ne sont pas endommagées.

      Au moment du passage devant le laser, les cellules émettent des signaux de diffusion de lumière et/ou de fluorescence. Les signaux de diffusion de lumière correspondent à des paramètres morphologiques : la diffusion frontale ou 'Forward Scatter' (FSC) reflète la taille des particules analysées et la diffusion latérale ou 'Side Scatter' (SSC) reflète leur densité. Les signaux d'émission de fluorescence sont recueillis par des détecteurs électroniques à l'aide de filtres spécifiques des fluorochromes utilisés :

  • pour l'analyse de la fluorescence verte (FITC), un filtre «Band pass» 530/30
  • pour l'analyse de la fluorescence orange (R-PE), un filtre «Band pass» 575/26

      Les signaux bruts (diffusion de lumière ou fluorescence) sont recueillis et amplifiés par les détecteurs du banc optique. Pour une même cellule, plusieurs paramètres de morphologie et de fluorescence sont enregistrés simultanément. L'analyse peut donc se faire selon un paramètre donné (analyse monoparamétrique) ou en associant 2 paramètres (analyse biparamétrique).

      

Fig. 10 : Représentation schématique d'un cytomètre-trieur en flux (d'après Becton-Dickinson).


Analyse monoparamétrique de la fluorescence

      Dans un premier temps, une fenêtre d'acquisition (R1) est créée (Fig. 11). Cette fenêtre définit une population cellulaire en fonction de ses paramètres morphologiques (FSC et SSC). Nous avons ainsi sélectionné la fenêtre correspondant aux lymphocytes qui exclut d'une part les débris cellulaires et d'autre part les autres leucocytes ou les cellules épithéliales. L'analyse de la fluorescence se fait uniquement sur les cellules incluses dans cette fenêtre. On réalise ensuite une acquisition sur des cellules non marquées (témoin négatif, conjugué seul sans anticorps primaire) pour évaluer la distribution de la fluorescence non spécifique ; on détermine ainsi un seuil de fluorescence au-delà duquel on considère que les cellules sont positives. Ce seuil peut varier en fonction de l'intensité de fluorescence du marquage (Fig.12).

      Le pourcentage de cellules positives est défini de la façon suivante : nombre de cellules dans la région choisie (au-delà du seuil de fluorescence non spécifique) / nombre total de cellules analysées.

      

Fig. 11 : Exemple d'analyse biparamétrique de la morphologie des cellules de la rate et des ganglions mésentériques. Les suspensions cellulaires préparées à partir de la rate et du ganglion mésentérique sont analysées au FACStar®Plus selon leurs caractéristiques morphologiques. L'axe des x représente la diffusion frontale de la lumière, ou 'Forward Scatter' (FSC) et reflète la taille des cellules. L'axe des y représente la diffusion latérale de la lumière, ou 'Side Scatter' (SSC) et reflète leur granulosité. A : Analyse de la suspension cellulaire issue de la rate ; B : Analyse de la suspension cellulaire issue du ganglion mésentérique. R1 représente le fenêtre d'acquisition sur laquelle sont analysés les paramètres de fluorescence.

      

Fig. 12 : Analyse monoparamétrique de la fluorescence d'un échantillon témoin. Analyse de la fluorescence non spécifique d'un échantillon témoin, sans anticorps primaire, contenant le conjugué seul (GAM-FITC dans ce cas). Les marqueurs M1 et M2 déterminent le seuil de fluorescence et délimitent la région réactive au-delà de laquelle les cellules sont considérées comme positives. Le marqueur M1 est fixé à 10 pour l'analyse du marquage des lymphocytes pan-T, le marqueur M2 est fixé à 20 pour l'analyse des marquages des lymphocytes CD4+ et CD8+ pour lesquels l'intensité de fluorescence est plus élevée.


Tri cellulaire


Analyse biparamétrique de la fluorescence

      Comme pour l'analyse monoparamétrique de la fluorescence, la première étape d'analyse consiste à créer une fenêtre d'acquisition correspondant aux lymphocytes. Sur cette fenêtre l'intensité de fluorescence verte d'une part (axe des x), et l'intensité de fluorescence orange d'autre part (axe des y) sont analysées simultanément. On définit des intensités seuils pour chaque fluorochrome par acquisition des paramètres des échantillons témoins négatifs ; on délimite ainsi 4 zones de marquage (Fig. 13).


Technique de tri

      

Fig. 13 : Analyse biparamétrique de la fluorescence après double marquage

      Des fenêtres de tri R3 et R4 (Fig. 13) sont sélectionnées dans les zones de simple marquage où les intensités de fluorescence sont maximales. La taille réduite de ces fenêtres et la forte intensité de fluorescence des cellules, permettent d'éviter la contamination de la population de cellules positives triées par des cellules négatives. La fenêtre de tri R4 définit la zone des lymphocytes B marqués à la fluorescéine, la fenêtre R3 la zone des lymphocytes T marqués à la phycoérythrine.

      Lors du tri, la veine liquide contenant les cellules est fractionnée en fines gouttelettes grâce aux vibrations d'un quartz piézoélectrique (Fig. 10). Du rapport entre le nombre de gouttelettes formées par la fréquence de vibration et le nombre de cellules injectées simultanément, dépend la qualité et la pureté du tri. Chaque gouttelette doit au maximum contenir une seule cellule. Ces gouttelettes sont ensuite chargées électriquement (charges positives ou négatives) puis déviées, grâce aux plaques de déflection, vers la droite ou vers la gauche selon les résultats de l'analyse effectuée quelques microsecondes plus tôt. Les cellules sont recueillies dans de petits tubes. La fraction de cellules que l'on ne désire pas récupérer tombe dans le réservoir de déchets.


Radiomarquage d'Eimeria coecicola in vivo

      Des essais de marquage d'E. coecicola in vivo à l'uracile tritiée ont été réalisés avec l'objectif de suivre les sporozoïtes marqués au cours de leur migration dans l'organisme du lapin jusqu'à leur organe cible.

      Toute la partie expérimentation animale de cette étude a été réalisée dans les installations agrémentées pour l'usage des radioisotopes in vivo dans l'Unité d'Imagerie de Ciblage et Vectorisation de la faculté de Médecine de Tours (N° agrément B372613).


Injection d'uracile tritiée in vivo

      Lors de la mise au point de la technique de marquage des parasites, l'uracile tritiée (NET368005MC, NEN Life Science Products, Zaventem, Belgique) a été injectée in situ dans l'appendice vermiforme. L'injection dans l'appendice nécessite une intervention chirurgicale et, pour les injections multiples, la mise en place d'un dispositif d'injection. Ce dispositif consiste en un cathéter souple de type microperfuseur épicranien avec site d'injection dont on a ôté l'aiguille. Le cathéter sectionné est introduit et fixé à l'extrémité distale de l'appendice et le site d'injection est fixé sur le dos du lapin. L'uracile est ainsi administrée à l'aide d'une seringue et d'une aiguille, de l'extérieur, à travers le site d'injection en caoutchouc.


Mesure de la radioactivité


Mesure de la radioactivité au compteur b


Préparation des échantillons d'organes

      La mesure de la radioactivité contenue dans les organes des lapins producteurs d'oocystes marqués ou des lapins inoculés avec les oocystes marqués a été réalisée de la façon suivante. Les organes sont prélevés, pesés puis découpés à l'aide de lames de scalpel à usage unique en fragments d'un poids inférieur à 200 mg (~190 mg). Ces fragments sont ensuite hachés finement, transférés dans des fioles de verre et recouverts de 2 ml de soluène-350 (6003038, Packard Bioscience, Groningen, NL). Les fioles sont mises à l'étuve à 48°C jusqu'à digestion complète des fragments et obtention d'une solution parfaitement limpide (environ 72 heures). La solution obtenue doit être de couleur jaune ambrée pour éviter les problèmes de luminescence trop importante lors du comptage. Si la solution est trop foncée une étape supplémentaire est nécessaire : on ajoute 1 ml d'alcool isopropylique que l'on laisse agir 10 min puis, goutte à goutte, 300 à 500 µl maximum d'eau oxygénée 110 volumes jusqu'à décoloration.

      Pour mesurer la radioactivité incorporée par les parasites, une quantité connue d'oocystes est soit broyée avec des billes de verre soit directement solubilisée comme décrit ci-dessus.


Mesure de la radioactivité

      Douze ml de liquide scintillant (Hionic Fluorä, 6013319, Packard Bioscience) sont ajoutés dans les fioles contenant les parasites ou les organes solubilisés. Après 10 min à l'obscurité, la radioactivité est mesurée dans un compteur b à scintillation liquide (Packard A500CD).


Mesure et localisation de la radioactivité sur les coupes avec le b-imager

      Le b-imager est un détecteur sensible à tous les types de rayonnement b- y compris celui du tritium. Cet appareil comprend une chambre à faces parallèles, dans laquelle règne un fort champ électrique et où circule un mélange gazeux à base d'argon et de triéthylamine. L'échantillon radiomarqué (coupe de tissus sur une lame de verre) est en contact direct avec la chambre. Chaque particule b émise lors de la désintégration d'un radioélément crée une avalanche d'électrons qui induisent l'apparition d'un signal lumineux directement enregistré par une caméra CCD (Charged Coupled Device). L'appareil est relié à un ordinateur qui à l'aide d'un algorithme de reconstruction enregistre la position précise du point émetteur. Chaque flash est ainsi compté comme une désintégration localisée au pic d'intensité ; l'image résulte de l'accumulation de ces signaux. Le b-imager fournit à la fois la localisation des sites radiomarqués et la quantification directe du marquage radioactif (Laniece et al., 1998).


Détection des parasites marqués par autoradiographie

      Pour vérifier que la radioactivité mesurée au niveau des tissus correspond à une émission par les parasites, après passage des coupes au b-Imager, une détection par autoradiographie permettant d'atteindre une résolution plus importante est réalisée (A. Cardona, Institut Pasteur).

      Les coupes de tissus congelés sont fixées sur les lames par dessiccation à froid (-20°C). Une émulsion photographique Kodak NTB2 diluée dans de l'acétate d'ammonium est directement coulée sur le tissu. A l'issue d'une exposition de 30 à 90 jours, le film à la surface des lames est développé. Les coupes sont plongées dans une solution de révélateur (Kodak Developer D-19) pendant 3 min, puis dans l'eau (10 secondes). Une fixation de 5 min est réalisée avec le fixateur Kodak fixer, puis les lames sont rincées à l'eau courante 2 à 5 min.

      Une contre-coloration à l'hématoxyline est effectuée. Après déshydratation dans différents bains d'alcool (70%, 95% et 100%) et dans un bain de toluène pendant 2 min, les lames sont montées avec le milieu de montage Eukitt medium.


Exploration de l'immunité fonctionnelle


Dosage des IgG sériques


Prélèvements de sang et récupération des sérums

      Dix millilitres de sang sont prélevés de la veine principale de l'oreille dans des tubes secs. Les prélèvements sont laissés 1 heure à 37°C puis refroidis à 4°C jusqu'à rétraction du caillot. Le sérum est prélevé et congelé à -20°C.


Réalisation du test ELISA

      Dans les plaques de microtitration 96 puits à fond plat (Laboratoire Dynatech, Rungis, France) sont déposés 100 µl d'antigènes solubles d'E. intestinalis (Cf. § B.4), en solution à 10 µg/ml, dans du tampon carbonate 0,1M (pH 9,6). Après une nuit d'incubation à 4°C, les plaques sont lavées 3 fois avec du PBS/Tween 20 0,05% et saturées pendant 1 heure à 37°C avec 200 µl/puits de PBS/lait 2%. La solution de saturation est ensuite éliminée et 100 µl des sérums à doser, dilués dans du PBS, sont déposés dans les puits. Après 2 heures d'incubation à 37°C et 3 lavages, un anticorps anti-IgG de lapin préparé chez la chèvre (GAR/IgG, Nordic), dilué au 1/8000ème dans du PBS/lait 1% est déposé à raison de 100 µl/puits et mis à incuber 1 heure à 37°C. Les plaques sont lavées 3 fois puis le conjugué couplé à la peroxydase, préparé chez le porc (SwAG/PO, Nordic), dilué au 1/5000ème, est déposé à raison de 100 µl/puits. Après 1 heure d'incubation à 37 °C et 3 lavages, 100 µl du substrat de l'enzyme (ABTS) dans du tampon citrate 0,1 M (pH 4) contenant de l'eau oxygénée à 1%, sont ajoutés. Au bout d'1 heure de révélation à 37°C, la densité optique est lue au spectrophotomètre à 405 nm.


Expression du titre en anticorps

      Les résultats sont exprimés en titre en IgG sériques. Le titre en anticorps correspond à l'inverse de la dernière dilution pour laquelle l'absorbance à 405 nm est supérieure ou égale à 2,5 fois l'absorbance d'un sérum témoin (lapin non infecté) à la même dilution. Les titres sont exprimés en log2.


Mesure de la prolifération des leucocytes

      Les suspensions cellulaires de rate et de ganglion mésentérique sont préparées selon le protocole décrit au chapitre C.2.. Les antigènes solubles sont obtenus comme décrit au chapitre B.4..


Mise en culture des leucocytes

      Les cellules sont centrifugées pendant 10 min à 400 g et remises en suspension dans du milieu de culture complet (annexe 1) à la concentration de 2x106 cellules/ml. La suspension est répartie à raison de 100 µl/puits dans des plaques de culture 96 puits à fond rond (Falcon, 3077). A ces cellules sont ajoutés 100 µl soit, de milieu seul (témoin négatif de prolifération spontanée), soit de milieu contenant 5 µg/ml de Concanavaline A, soit de milieu contenant 5 ou 10 µg/ml d'antigènes parasitaires solubles. La Concanavaline A (ConA) est un stimulant non spécifique de la prolifération lymphocytaire et sert de témoin positif. Six répétitions sont réalisées par mesure. Les cellules sont mises à incuber à 37°C sous atmosphère humide (5% CO2, 90% d'humidité).


Mesure du taux de multiplication des leucocytes par incorporation de thymidine tritiée

      Après 72 heures d'incubation en présence de ConA ou 120 heures d'incubation en présence d'antigènes parasitaires, les cellules sont incubées pendant 6 heures avec 1 µCi de thymidine tritiée/puits (ICN, Costa Mesa, CA) puis congelées. Les cellules sont lysées par décongélation et le contenu des puits aspiré sur des filtres (ICN, 78-115-05) à l'aide d'un micromanipulateur semi-automatique. Chaque filtre est transféré dans un tube en polypropylène dans lequel sont ajoutés 2ml de liquide scintillant (OCS, Amersham). La radioactivité incorporée par les cellules en multiplication est mesurée dans un compteur b à scintillation liquide (Kontron Betametrix). Les résultats obtenus sont exprimés en coups par minutes (cpm). Ils représentent la différence entre l'incorporation de la thymidine par les cellules en culture en présence d'antigènes ou de mitogènes et celle des cellules en culture en présence de milieu seul (moyenne des 6 répétitions).


Analyse statistique des résultats

      Le test de Student a été utilisé pour déterminer les degrés de signification dans les numérations de cellules, les tests ELISA et les TTL.

      Pour les comparaisons de pourcentages lors des analyses de populations cellulaires nous avons utilisé un test de Tukey sur les valeurs transformées (ASIN(Ö %)). Le seuil de signification est fixé à p < 0,05.


Résultats
Etude de la phase précoce du cycle parasitaire


Stratégie d'étude de la phase d'invasion parasitaire

      Les expériences portant sur l'étude du cycle parasitaire ont concerné essentiellement E. coecicola, cependant, certaines ont également été réalisées avec E. intestinalis à titre de comparaison. Cette étude comportait plusieurs objectifs, d'une part, mettre en évidence les différents sites extra-intestinaux du parasite et démontrer l'existence d'un trajet migratoire, d'autre part, déterminer quels types de cellules lymphoïdes hébergent les sporozoïtes pendant la phase d'invasion.

      Nous avons utilisé 3 approches complémentaires :


Protocoles utilisés pour les études immunohistologiques

      Les études immunohistologiques avaient pour objectif de détecter les sites extra-intestinaux du parasite après inoculation intraduodénale, de déterminer la chronologie d'infection des différents segments intestinaux et des organes lymphoïdes au cours de l'invasion, et de démontrer le tropisme du sporozoïte pour le GALT après inoculation extra-intestinale. Ces expériences ont été réalisées en parallèle sur des animaux primo-infectés et sur des animaux immunisés pour déterminer à quel stade du cycle parasitaire agit l'immunité : la pénétration, la migration et/ou la multiplication.

      La voie orale est la voie naturelle d'infection. Toutefois, l'inoculation par injection intraduodénale des parasites (oocystes, sporocystes, et/ou sporozoïtes) permet une certaine synchronisation des différentes étapes du cycle parasitaire ; ainsi le nombre de parasites présents dans un site donné à un moment donné est plus élevé qu'après infection par voie orale.

      Malgré cette synchronisation, pour pouvoir détecter les parasites sur les coupes il est nécessaire d'inoculer les animaux avec de fortes doses de parasites. Les lapins sont abattus à des temps variables après l'inoculation, de quelques minutes à 70 h.p.i..


Protocole de transfert de tissus ou de cellules infectés


Injection de suspensions cellulaires de différents organes

      Des lapins dits 'donneurs' sont inoculés par voie intraduodénale (Cf. § B.4.2, p48) avec 5x106 sporocystes et sacrifiés à des temps variables après l'inoculation (15, 23, 34, 40, 46 et 65 h.p.i.). Des suspensions cellulaires sont préparées à partir des différents organes du donneur (Cf. § C, p49) et injectées par voie intraveineuse à des lapins dits 'receveurs', exempts de coccidies. Chaque lapin receveur reçoit 108 cellules provenant d'un organe d'un lapin donneur (Fig. 14). Les lapins sont placés en microisolateurs pendant 6 jours afin d'éviter toute contamination, puis transférés dans des cages individuelles en salles d'expérimentation pour les collectes de fèces. Pour chaque expérience, un lapin témoin non inoculé (lapin sentinelle) est placé au hasard parmi les cages et permet de vérifier la non-contamination des animaux par le matériel et les diverses manipulations. L'excrétion d'oocystes par les lapins receveurs atteste de la viabilité et de la conservation du pouvoir infectant des parasites présents dans les organes du donneur. Les abattages d'animaux donneurs effectués à différents temps post-inoculation permettent de déterminer une éventuelle chronologie dans l'infection des différents organes. Les expériences sont réalisées plusieurs fois (2 à 5 fois) pour chaque temps d'abattage.

      

Fig. 14 : Protocole de transfert d'organes - Mise en évidence d'une phase extra-intestinale pour E. coecicola. PBL : leucocytes sanguins


Injections de populations de lymphocytes purifiées

      Parallèlement à la réalisation des protocoles précédents nous avons recherché quel(s) type(s) cellulaire(s) héberge(nt) le parasite au cours de sa phase invasive.

      Les études en microscopie électronique réalisées par Pakandl et al. (1993, 1996) avaient montré que dans le duodénum comme dans l'appendice vermiforme les sporozoïtes étaient présents dans des cellules lymphoïdes. Nous avons donc recherché si les parasites étaient présents à la fois dans les lymphocytes B (IgM+) et/ou les lymphocytes T. Comme précédemment, la méthode utilisée consiste à reproduire l'infection chez des lapins indemnes de coccidies par injection de lymphocytes triés issus d'intestins de lapins infectés.

      A partir des suspensions cellulaires issues du duodénum et de l'appendice vermiforme des lapins donneurs, un double marquage des lymphocytes IgM+ (révélés par un fluorochrome vert) et T (révélés par un fluorochrome orange) est réalisé (Cf. § D.2.3, p55). Les 2 populations lymphocytaires sont ensuite séparées (Cf. § D.2.5, p58) ; 105 lymphocytes de chaque type sont injectés aux lapins receveurs (Fig. 15). L'excrétion d'oocystes par les lapins receveurs atteste de la viabilité et de la conservation du pouvoir infectant des parasites présents dans les lymphocytes du donneur. Les expériences sont réalisées plusieurs fois (2 à 5) pour chaque temps d'abattage.

      

Fig. 15 : Protocole de transfert de cellules triées - Détermination des types de cellules lymphoïdes hébergeant le sporozoïte.


Recherche du trajet migratoire de parasites radiomarqués

      Nous avons ensuite cherché à montrer que non seulement le parasite est présent et vivant au niveau extra-intestinal mais qu'il s'agit d'un réel trajet migratoire pour celui-ci et non d'une impasse biologique. Nous avons donc essayé de suivre le parcours du parasite en le marquant avec des composés radioactifs.

      Des essais préliminaires avaient été réalisés au laboratoire (Drouet-Viard F., communication personnelle) avec des sporozoïtes d'E. intestinalis marqués in vitro à l'indium111 ; les sporozoïtes injectés par voie intraduodénale étaient détectés in vivo avec une gamma caméra. Ces essais ont été infructueux, les parasites s'étant révélés incapables de migrer après marquage.

      Nous avons repris cette étude en essayant un autre isotope. Des essais de marquage des oocystes d'E. coecicola à l'uracile tritiée ont été réalisés sachant que nous pouvions bénéficier d'une technologie performante à l'Institut Pasteur, le b-Imager, permettant l'analyse de la radioactivité sur des coupes d'organes, voire de petits animaux entiers. Les Apicomplexa possédant une activité uridine phosphorylase 100 fois supérieure à celle des cellules de mammifères (Pfefferkorn et Pfefferkorn, 1977), l'incorporation de l'uracile in vitro se fait quasi exclusivement dans la cellule parasitaire et non dans la cellule hôte. Cette incorporation de l'uracile dans les acides nucléiques du parasite se fait essentiellement au cours des phases de division cellulaire.

      A l'heure actuelle nous ne disposons de système de multiplication in vitro pour aucune des Eimeria du lapin. Nous avons donc dû marquer les oocystes d'E. coecicola in vivo. Nous avons fait le choix d'administrer l'uracile tritiée directement au site principal de multiplication, c'est-à-dire dans l'appendice vermiforme. Cet organe qui constitue un cul de sac anatomique est particulièrement développé chez le lapin et se prête facilement à une injection in situ de la solution radioactive ainsi qu'à la récupération des oocystes marqués. L'objectif était d'accroître l'efficacité du marquage en délivrant le produit actif directement au contact des cellules épithéliales dans lesquelles s'effectuent les mérogonies. Cette méthode, comparée à l'injection par voie intraveineuse, permettait également de réduire la quantité d'uracile à administrer au lapin. Des lapins EOPS ont été inoculés per os avec 2500 oocystes d'E. coecicola et l'uracile tritiée a été injectée à partir du 5ème jour post-inoculation (Cf. § E.1, p59). Les animaux ont été abattus les 10èmeou 11ème jour, les oocystes marqués récupérés (Cf. § B.2.1.2, p46) et mis à sporuler.

      Les sporocystes marqués ont ensuite été utilisés pour inoculer des lapins indemnes de coccidies qui ont été abattus à des temps variables après l'inoculation (Fig. 16). La présence du parasite radiomarqué chez ces lapins receveurs a été recherchée par marquage immunohistochimique sur coupes d'organes, par mesure de la radioactivité dans les organes au compteur-b à scintillation liquide, par détection de la radioactivité sur des coupes de tissus sériées, avec le b-Imager et par autoradiographie (Cf § E.2, p60).

      

Fig. 16 : Protocole d'étude du trajet migratoire d'E. coecicola par utilisation d'oocystes marqués à l'uracile tritiée.


Résultats


Migration du sporozoïte d'E. coecicola vers son organe cible


Répartition du parasite dans les différents tissus au cours de l'invasion de l'organisme


Inoculation par voie intraduodénale

      Dans le duodénum, sous l'action des sels biliaires et de la trypsine, les sporozoïtes excystent rapidement et pénètrent in situ, dans les entérocytes, en quelques minutes.

      Lapins naïfs

      Dans les heures qui suivent l'inoculation, les sporozoïtes sont observés dans les cellules lymphoïdes de la lamina propria du duodénum (Fig. 17A). Leur nombre diminue après 23 h.p.i. (Tab. 7) mais certains sont encore présents dans ce segment 65 heures après l'inoculation (Fig. 17B), alors que la première mérogonie débute dans l'appendice vermiforme. Dans l'appendice, les parasites sont absents 15 h.p.i. (Fig. 17C) ; ils ne sont observés à la base des dômes qu'à partir de la 23ème heure, leur nombre augmente jusqu'à 65 h.p.i. (Fig. 17D), et 70 h.p.i. des mérozoïtes sont visibles dans les cellules épithéliales des cryptes (Fig.17E et F). Remarquons que lorsque les animaux sont inoculés avec de très fortes doses de parasites (Tab. 7B), des sporozoïtes sont observés dans la lamina propria de l'iléon dès 6 h.p.i.. Leur nombre s'accroît, atteint un maximum 46 h.p.i. puis diminue. Dans tous les cas, quel que soit le segment intestinal étudié, jamais les sporozoïtes n'ont été observés dans la lumière intestinale.

      Les parasites sont également présents dans la rate et les ganglions mésentériques à partir de 15 h.p.i. avec un pic 23 h.p.i.. Dans la rate, les sporozoïtes se trouvent au niveau de la pulpe blanche (Fig. 18A) et, dans les ganglions mésentériques, on les observe à la périphérie des follicules (Fig. 18B). Lorsque les doses inoculées sont importantes la densité parasitaire dans ces 2 organes continue à augmenter jusqu'à 46 h.p.i. (Tab. 7B) et reste élevée 70 h.p.i..

      

Fig. 17 : Marquage immunochimique des sporozoïtes d'E. coecicola sur des coupes d'intestin de lapins inoculés par injection intraduodénale de sporocystes. A : duodénum 15 h.p.i. ; B : duodénum 65 h.p.i. ; C : appendice 15 h.p.i. ; D : appendice 65 h.p.i. ; E : appendice 70 h.p.i. (x1250) ; F : appendice 70 h.p.i. (x2500). A. B. C. D. : les lapins ont été inoculés avec 5 x 106 sporocystes ; E. F. : les lapins ont été inoculés avec 4 x 107 sporocystes marqués à l'uracile tritiée.

      

Tab. 7 : Distribution des sporozoïtes d'E. coecicola dans les organes des lapins inoculés par injection intraduodénale de sporocystes. Les lapins sont inoculés par injection de sporocystes dans le duodénum et sacrifiés 6, 15, 23, 46, 65 et 70 heures après l'inoculation (h.p.i.). La présence des sporozoïtes dans les différents organes est recherchée par marquage immunohistochimique. Les résultats obtenus représentent le nombre moyen de sporozoïtes/coupe d'organe après examen d'au moins 12 coupes de 7 µm d'épaisseur. A : Lapins inoculés avec 5 x 106 sporocystes ; B : Lapins inoculés avec 4 x 107 sporocystes marqués à l'uracile tritiée. 0 sporozoïte : - ; 1-5 : +/- ; 5-10 : + ; 10-20 : ++ ; 20-50 : +++ ; ³ 50 : ++++ ; ** : ³ 300.

      

Fig. 18 : Marquage immunochimique des sporozoïtes d'E. coecicola sur des coupes d'organes de lapins inoculés par injection intraduodénale de 4 x 107 sporocystes marqués à l'uracile tritiée (x 1250). A : rate 23 h.p.i. ; B : ganglions mésentériques 23 h.p.i.

      Lapins immuns

      Chez des lapins primo-infectés per os et réinfectés par voie intraduodénale les sporozoïtes pénètrent dans la muqueuse duodénale et sont retrouvés en grand nombre dans l'appendice vermiforme 70 heures après l'inoculation. Les parasites parvenus dans le GALT ne poursuivent pas leur développement. Au niveau extra-intestinal, les sporozoïtes sont également observés 48 et 64 h.p.i. dans la rate et les ganglions mésentériques.

      Chez les lapins hyper-immunisés per os (au-delà de 3 inoculations) et réinfectés par voie intraduodénale, la pénétration des sporozoïtes dans la muqueuse duodénale est considérablement affectée, très peu de parasites pénètrent.


Inoculation ex situ

      Nous avons voulu vérifier si le passage des parasites par la voie luminale était nécessaire à leur développement et s'ils atteignaient leur site de multiplication via les mêmes sites extra-intestinaux (ganglions mésentériques et rate). En fonction du but recherché différentes quantités de parasites sont utilisées : l'injection de fortes doses (2 x 107 sporozoïtes) permet de suivre les parasites dans les organes par marquage immunohistochimique, l'injection de doses plus faibles permet de mesurer l'excrétion parasitaire et de déterminer la proportion de sporozoïtes ayant achevé leur cycle.

      Injection de sporozoïtes par voie intraveineuse (IV)

      Injection à des animaux naïfs

      L'étude immunohistochimique montre que 15 heures après l'inoculation IV, les sporozoïtes sont retrouvés uniquement dans la rate (Tab. 8). Vingt-quatre heures après l'inoculation, ils sont observés à la fois dans les ganglions mésentériques et dans l'appendice vermiforme ; 65 h.p.i., les parasites sont présents à la fois au niveau extra-intestinal (rate et ganglions mésentériques) et en grand nombre dans l'appendice vermiforme. Les sporozoïtes sont donc susceptibles de gagner le GALT, et en particulier l'appendice vermiforme, dans le même délai que lors d'une inoculation intraduodénale.

      

Tab. 8 : Distribution des sporozoïtes d'E. coecicola dans les organes des lapins après injection intraveineuse. 2 x 107 sporozoïtes sont injectés par voie intraveineuse à des lapins receveurs sacrifiés 15, 24 et 65 h.p.i.. La présence des sporozoïtes dans les différents organes est recherchée par marquage immunohistochimique sur coupes. Les résultats obtenus représentent le nombre moyen de sporozoïtes/coupe d'organe après examen de 12 coupes de 7 µm d'épaisseur. 0 sporozoïte : - ; 1-5 : +/- ; 5-10 : + ; 10-20 : ++ ; 20-50 : +++ ; ³ 50 : ++++

      Les quatre animaux dont on a mesuré l'excrétion parasitaire ont été inoculés par voie intraveineuse avec soit 105 soit 5 x 105 sporozoïtes. L'excrétion totale d'oocystes des lapins ayant reçu l'inoculum le plus fort est maximale (³108), alors que l'excrétion d'oocystes des lapins inoculés avec 105 sporozoïtes est dans la gamme dose-dépendante (2 à 6 x107 oocystes). Sachant que 400 oocystes (soit 3200 sporozoïtes) inoculés per os permettent d'obtenir le maximum d'excrétion, moins de 3200 sporozoïtes c'est-à-dire moins de 3% des parasites injectés ont donc achevé leur cycle.

      Injection à des animaux hyper-immunisés

      Ces essais avaient pour but de déterminer si l'évitement du duodénum par les sporozoïtes permettait l'aboutissement de leur cycle chez les lapins hyper-immunisés. Malgré les fortes doses parasitaires inoculées, contrairement aux résultats obtenus avec les animaux naïfs, très peu de parasites sont retrouvés dans les organes des animaux hyperimmuns (Tab. 9). Ces résultats confirment que la barrière muqueuse intestinale n'est qu'un élément de la défense immunitaire chez les animaux immunisés.

      Parallèlement, l'excrétion d'oocystes par les animaux inoculés avec 105 ou 5x105 sporozoïtes n'est pas détectable ou extrêmement faible (7,7 x 104 oocystes pour un des lapins inoculés avec 105 sporozoïtes). L'inoculation per os d'un seul oocyste (8 sporozoïtes) permet l'excrétion de 3 x 105 oocystes ce qui signifierait ici, qu'avec une excrétion inférieure à 105 oocystes, moins de 8 sporozoïtes (soit moins de 0,008% des parasites) ont achevé leur cycle.

      

Tab. 9 : Distribution des sporozoïtes d'E. coecicola dans les organes de lapins hyper-immunisés inoculés par injection intraveineuse. 2 x 107 sporozoïtes sont injectés par voie intraveineuse à des lapins hyper-immunisés sacrifiés 15, 24 et 65 h.p.i.. La présence des sporozoïtes dans les différents organes est recherchée par marquage immunohistochimique sur coupes. Les résultats obtenus représentent le nombre moyen de sporozoïtes/coupe d'organe après examen de 12 coupes de 7 µm d'épaisseur. 0 sporozoïte : - ; 1-5 : +/- ; 5-10 : + ; 10-20 : ++ ; 20-50 : +++ ; ³ 50 : ++++

      Inoculation de parasites par d'autres voies

      D'autres voies d'inoculation, intestinales ou extra-intestinales, ont été testées : des inoculations de sporozoïtes dans le côlon et le rectum (les animaux inoculés par ces 2 voies ont porté des colliers pendant 24 heures afin d'éviter une contamination per os par caecotrophie ou léchage), des inoculations de sporozoïtes par voie intramusculaire (IM), intra- péritonéale (IP), intra-splénique et intra-utérine. La présence d'oocystes dans l'appendice vermiforme 12 jours après l'inoculation (fin de l'excrétion) est mise en évidence sur des frottis lors de l'abattage.

      Après une injection de 5 x 105 sporozoïtes, l'excrétion est maximale (³108 oocystes) dans tous les cas, quelle que soit la voie d'inoculation (Tab. 10). En revanche, 24 heures après l'injection, aucun parasite n'est observé sur les coupes de rate et de ganglions mésentériques quelle que soit la voie d'inoculation ; au niveau du site d'inoculation, quelques parasites ont pu être observés in situ uniquement chez les lapins inoculés dans le côlon.

      

Tab. 10 : Excrétion totale d'oocystes par lapin inoculé par injection ex situ de sporozoïtes d'E. coecicola. IM : injection intramusculaire (dans le râble) ; IP : injection intra-péritonéale.

      L'injection d'oocystes dans le duodénum ou dans l'utérus a également permis d'obtenir un développement complet du parasite. La voie utérine semble aussi efficace que la voie duodénale puisqu'à des doses injectées égales, les excrétions d'oocystes sont égales.


Organes et cellules hébergeant le sporozoïte au cours de sa migration

      Toutes les expériences de transfert de tissus et de cellules triées ont été réalisées avec E. coecicola. L'objectif était double : d'une part confirmer que les parasites présents au niveau extra-intestinal étaient viables et infectants, d'autre part, déterminer le type de cellules lymphoïdes hébergeant le parasite au niveau de son site de pénétration dans l'organisme, le duodénum, et de son site de multiplication, l'appendice vermiforme.


Transfert de suspensions cellulaires

      Les lapins EOPS ont reçu des injections de suspensions cellulaires (108 cellules) préparées à partir d'organes de lapins donneurs infectés et sacrifiés 15 à 65 h.p.i. (Fig. 14). L'excrétion totale d'oocystes des animaux receveurs a été mesurée du 6ème au 12ème jour après l'injection des cellules (Fig. 19).

      La période prépatente d'E. coecicola est de 9 jours après inoculation per os. La récolte quotidienne des excréta les 6ème, 7ème et 8ème jours après inoculation, permet de détecter les premiers oocystes excrétés et de déterminer ainsi la modification de la durée de la période prépatente

      

Fig. 19 : Excrétion totale d'oocystes par lapin inoculé par voie intraveineuse avec des suspensions cellulaires provenant d'organes de lapins donneurs infectés par E. coecicola. Les lapins donneurs sont sacrifiés à des temps variables après inoculation intraduodénale avec des sporocystes d'E. coecicola. Différents organes de ces donneurs sont prélevés et 108 cellules de chaque organe sont injectées par voie intraveineuse à des lapins receveurs. Chaque receveur reçoit les cellules de 1 (ou 2 pour le duodénum) donneur infecté. L'excrétion d'oocystes des lapins receveurs est mesurée du 6ème au 12ème jour après l'injection des cellules. Les résultats donnés représentent la moyenne de l'excrétion totale d'oocystes obtenue par lapin au cours des différentes expérimentations (2 à 4 lapins par point). PBL : leucocytes sanguins ; GM : ganglions mésentériques.

      Tous les organes des lapins donneurs testés sont infectés puisqu'ils induisent une excrétion parasitaire chez les receveurs. Cependant, l'excrétion des lapins receveurs varie en fonction de l'origine des cellules injectées. Ainsi l'excrétion après transfusion de sang ou de leucocytes sanguins (PBL) bien que détectable à tous les temps testés est parfois très faible, voire à la limite de sensibilité de la technique de numération (excrétion totale d'oocystes £104). L'injection de suspensions cellulaires issues des organes lymphoïdes (ganglions mésentériques, rate) et de l'intestin (duodénum, appendice vermiforme conduit à des excrétions d'oocystes plus importantes.

      Les résultats obtenus varient également en fonction du temps de développement du parasite chez les lapins donneurs. Ainsi, les cellules issues de l'appendice vermiforme 15 h.p.i. ne sont pas encore parasitées alors que le transfert des cellules des animaux abattus 40 et 65 h.p.i. induit une excrétion d'oocystes maximale. Les cellules du duodénum transfèrent encore l'infection 65 h.p.i..

      Après injection des suspensions de cellules d'appendice, la période prépatente chez les lapins receveurs varie de 7 à 8 jours (au lieu de 9 jours) en fonction du stade de développement parasitaire chez le lapin donneur : plus le délai entre l'inoculation et l'abattage du lapin donneur est long, plus la période prépatente chez le lapin receveur est courte.


Expériences de transfert de lymphocytes triés

      Parallèlement au protocole précédent, une partie des cellules extraites du duodénum et de l'appendice vermiforme subit une étape supplémentaire de double marquage des lymphocytes. Les 2 populations B (IgM+) et T sont séparées à l'aide d'un analyseur-trieur de cellules puis injectées séparément à des lapins receveurs (Fig. 15).

      Les mesures d'excrétion d'oocystes sont réalisées comme dans le protocole précédent.


Analyse cytométrique des suspensions cellulaires avant tri

      Une fenêtre d'acquisition correspondant aux paramètres morphologiques (FSC et SSC) des lymphocytes est créée (Fig. 20) et les paramètres de fluorescence sont ensuite analysés sur les cellules de cette fenêtre (Fig. 21)

      

Fig. 20 : Analyse biparamétrique de la morphologie des suspensions cellulaires issues du duodénum et de l'appendice vermiforme. Les suspensions cellulaires préparées à partir du duodénum et de l'appendice vermiforme sont analysées au FACStar®Plus selon leurs caractéristiques morphologiques. L'axe des x représente la diffusion frontale de la lumière, ou 'Forward Scatter' (FSC), et reflète la taille des cellules ; l'axe des y représente la diffusion latérale de la lumière, ou 'Side Scatter' (SSC), et reflète leur densité. A : Analyse de la suspension cellulaire issue du duodénum ; B : Analyse de la suspension cellulaire issue de l'appendice vermiforme. R1 représente la fenêtre d'acquisition sur laquelle sont analysés les paramètres de fluorescence.

      

Fig. 21 : Analyse biparamétrique de la fluorescence verte (FITC) et de la fluorescence orange (R-PE) des lymphocytes de l'appendice vermiforme après double marquage. A/ axe des x : lymphocytes marqués IgM+-FITC ; axe des y : lymphocytes marqués pan-T-R-PE. R3 et R4 correspondent aux fenêtres de tri respectives des lymphocytes pan-T et B-IgM+. La région en bas à gauche correspond aux lymphocytes non marqués, la région en haut à droite aux lymphocytes doublement marqués. B/ Analyse en cytométrie en flux des lymphocytes T triés. C/ Analyse en cytométrie en flux des lymphocytes B triés.

      Le double marquage est une méthode fiable pour séparer les lymphocytes simplement marqués IgM+ des lymphocytes T simplement marqués en excluant les cellules non marquées et les lymphocytes doublement marqués (Fig. 21A). Cependant, dans toutes les expériences le nombre de lymphocytes doublement marqués est très faible. Pour éviter toute contamination par ces lymphocytes ou les cellules non marquées, les fenêtres de tri (R3 et R4) sont très étroites.


Analyse cytométrique des suspensions lymphocytaires après tri

      L'analyse des suspensions lymphocytaires triées a permis de vérifier la pureté des préparations. Le pourcentage de cellules marquées est supérieur à 98% (Fig. 21B et C). Certains lymphocytes résistent mal au tri cellulaire ; ainsi parmi les 2% de cellules négatives se trouvent inclus des débris cellulaires. L'analyse a également confirmé l'absence de contamination croisée entre lymphocytes B-IgM+ et T. De plus pour conserver ce degré de pureté, le nombre de lymphocytes triés a été limité à 105 lymphocytes de chaque type (IgM+ ou T) provenant soit de l'appendice vermiforme d'un donneur soit des duodénums de 2 donneurs groupés.


Excrétion parasitaire chez les lapins receveurs de lymphocytes triés

      Nous avons cherché à quantifier le nombre de lymphocytes parasités parmi l'ensemble des lymphocytes injectés.

      Nous avons établi que 105 lymphocytes injectés permettent l'obtention d'une excrétion parasitaire chez les animaux receveurs qui se situe dans la gamme dose-dépendante de l'excrétion (³108 oocystes). L'excrétion d'oocystes des lapins ayant reçu les lymphocytes triés est donnée ci-après (Fig.22).

      

Fig. 22 : Excrétion totale d'oocystes d'E. coecicola par lapin inoculé par voie intraveineuse avec 105 lymphocytes triés provenant de lapins donneurs infectés. Les lapins donneurs sont sacrifiés à des temps variables après inoculation intraduodénale de sporocystes d'E. coecicola.. Les lymphocytes sont préparés à partir de l'intestin des lapins donneurs, et, pour chaque type de population lymphocytaire, 105 lymphocytes triés sont injectées par voie intraveineuse à un lapin receveur. Chaque receveur reçoit les lymphocytes d'un (ou 2 pour le duodénum) donneur infecté. Les excrétions d'oocystes des lapins receveurs sont mesurées du 6ème au 12ème jour après l'injection des cellules. Les résultats donnés représentent la moyenne des excrétions totales obtenues par lapin au cours des différentes expérimentations (2 à 5 lapins par point). Pour les expériences réalisées à 40 h.p.i., les lymphocytes ont été simplement marquées avec l'anticorps anti-IgM ou l'anticorps anti-CD5.

      Les 2 types de lymphocytes, B (IgM+) et T, extraits du duodénum des donneurs infectés depuis 15 heures sont capables de transférer l'infection. Les cellules non marquées (de la région doublement négative T-B-) peuvent transférer l'infection mais l'excrétion d'oocystes est très faible, 100 à 1000 fois moins élevée que l'excrétion obtenue avec les lymphocytes B ou T.

      Les lymphocytes B comme les lymphocytes T provenant de l'appendice de lapins donneurs infectés depuis plus de 34 heures provoquent une infection chez les lapins receveurs et ceci à tous les temps testés. Comme pour le duodénum, les cellules non marquées (B-T-) transfèrent l'infection mais l'excrétion d'oocyste est 100 à 1000 fois plus faible que celle obtenue avec les lymphocytes marqués.


Etude du trajet migratoire d'E. coecicola après radiomarquage in vivo des parasites


Mise au point de la technique de marquage des parasites in vivo

      Pour le marquage des parasites in vivo, l'uracile tritiée a été injectée in situ dans l'appendice vermiforme en une ou plusieurs fois. Trois protocoles ont été réalisés pour déterminer la dose optimale d'uracile tritiée à utiliser, le mode d'administration le plus satisfaisant (dose unique ou fractionnée) et le moment du cycle le plus approprié pour commencer l'administration de l'uracile (Tab. 11).


Essai 1 : approche du rendement d'incorporation de l'uracile tritiée dans les oocystes et de l'efficacité d'une administration fractionnée (pulses)

      De faibles doses totales de radioactivité ont été utilisées (220µCi ou 450µCi). Les doses ont été injectées en une ou plusieurs fois afin d'évaluer l'efficacité des pulses par rapport à l'injection unique. Six jours après l'inoculation, l'uracile tritiée a été injectée in situ à 3 lapins et le dispositif de récupération des oocystes mis en place (Tab. 11). Le cathéter pour les injections par pulses a été posé sur 1 lapin (L3).

      

Tab. 11 : Différents essais et de marquage in vivo d'Eimeria coecicola à l'uracile tritiée. Les lapins sont inoculés per os au jour J0 avec 2500 oocystes d'E. coecicola. Les parasites sont marqués par injection d'uracile tritiée in situ, dans l'appendice vermiforme, en une ou plusieurs fois à partir du 5ème ou 6ème jour après l'inoculation. Un dispositif de récupération des oocystes, constitué d'un réservoir en latex, est abouché à l'extrémité distale de l'appendice entre le 6ème et le 8ème jour post-inoculation. Les oocystes sont récupérés dans l'appendice et dans le réservoir au 10ème ou 11ème jour après l'inoculation. Une partie des oocystes est broyée et la radioactivité incorporée, présente dans le broyât, mesurée au compteur-b à scintillation. Le rendement d'incorporation est exprimé en µCi/oocyste.

      Les animaux ont été sacrifiés 10 jours après l'inoculation et les oocystes ont été récupérés (Cf B.2.1.2, p46). La radioactivité incorporée a été comptée au compteur-b à scintillation sur un échantillon d'oocystes (Tab. 11).

      Le meilleur résultat a été obtenu avec la plus faible dose d'uracile tritiée (220 µCi) injectée en une fois (lapin L1). Le rendement est 10 fois supérieur à celui obtenu avec la dose de 450 µCi (lapin L2) ; cependant, ce lapin a produit presque 5 fois plus d'oocystes que le lapin ayant reçu 220 µCi. Le rendement d'incorporation des oocystes du lapin L3 ayant reçu 360 µCi par pulses est également nettement inférieur à celui du lapin L1.

      Ainsi, le fractionnement de la dose administrée n'a pas eu d'effet positif sur le rendement d'incorporation de l'uracile tritiée dans les oocystes et l'augmentation de la dose d'uracile tritiée n'a pas permis d'augmenter ce rendement.


Essai 2 : évaluation de l'incorporation maximale d'uracile par les parasites

      Nous avons évalué l'efficacité de l'incorporation de l'uracile tritiée dans les oocystes après injection d'une dose unique, nettement supérieure à celles de l'essai 1, pour déterminer un seuil maximum d'incorporation. Des doses de 1000 à 2500 µCi ont été injectées aux lapins L4 à L6 (Tab. 11). Sur un des lapins (L4), nous avons réalisé une administration en 2 fois en commençant plus précocement au cours du cycle parasitaire pour permettre l'incorporation d'uracile tritiée lors de la mérogonie précédente ; dans ce cas, le cathéter a été mis en place à J5. Les dispositifs de récupération des oocystes ont été posés à J6.

      Le meilleur rendement a été obtenu avec le lapin ayant reçu le radiotraceur en 2 injections. Bien que la dose de radioactivité totale (1500 µCi) soit plus faible que celle injectée au lapin L5 (2500 µCi), l'injection plus précoce semble avoir permis une meilleure incorporation de l'uracile tritiée dans les parasites. Dans les 2 cas d'une injection unique, la dose la plus forte (2500 µCi) permet cependant d'obtenir un meilleur taux d'incorporation que la dose de 1000 µCi.

      L'administration fractionnée de doses intermédiaires de radiotraceur le plus précocement possible au cours du cycle parasitaire a semblé un bon compromis pour obtenir un rendement optimum d'incorporation de l'uracile tritiée dans les oocystes.


Essai 3 : administration précoce de doses modérées et fractionnées

      Nous avons cherché à optimiser le rendement et mis à profit les conclusions de nos 2 premiers essais. Quatre lapins ont été utilisés et ont reçu chacun de 1000 à 1350 µCi par pulses de 250 µCi toutes les 12 heures à partir de J5. Les cathéters ont été posés à J5 et les dispositifs de récupération des oocystes à J7 ou J8 (Tab. 11). Les animaux ont été sacrifiés le 10ème ou le 11ème jour après l'inoculation.

      Le taux d'incorporation de l'uracile dans les oocystes a été faible, équivalent à celui obtenu lors du premier essai avec des doses de radiotraceur injectées 5 fois moindres.


Diffusion de la radioactivité dans les tissus des lapins producteurs d'oocystes

      Différents organes ont été prélevés sur les lapins donneurs L4 à L10 afin d'estimer la diffusion du radiotraceur non associé aux parasites dans l'organisme des animaux. Pour chaque organe, la radioactivité est mesurée sur 4 échantillons d'environ 200 mg. La moyenne des valeurs obtenues ramenée au poids total de l'organe permet d'estimer la répartition globale de la radioactivité dans les différents organes du lapin. La mesure de la radioactivité exprimée par gramme d'organe permet d'estimer la concentration de l'uracile tritiée dans un ou plusieurs organe(s) donné(s).

      Lors du deuxième essai (lapins L4 à L6), des prélèvements d'appendice vermiforme, d'iléon et de foie ont été effectués. Les résultats montrent qu'aussi bien en terme de répartition dans l'organisme (Fig. 23A) que de concentration dans les tissus (Fig. 23B), la radioactivité reste essentiellement confinée au site d'injection, dans l'appendice vermiforme.

      Au cours du troisième essai (lapins L7 à L10), des prélèvements de sang, d'appendice, d'iléon et de foie ont été effectués lors de l'abattage. Contrairement à ce qui a été observé pour les lapins L4 à L6, les composés radioactifs semblent avoir davantage diffusé dans l'organisme des animaux (Fig. 23). La quantité de radioactivité émise par le sang et le foie montre que la diffusion systémique est importante (A). La concentration est également plus importante dans les tissus environnants (B). Pour le lapin L7 seulement, la radioactivité est davantage confinée dans l'appendice.

      

Fig. 23 : Répartition et concentration de la radioactivité dans les organes des lapins producteurs d'oocystes marqués à l'uracile tritiée. Les lapins L4 à L10 sont inoculés per os avec 2500 oocystes d'E. coecicola. De l'uracile tritiée est injectée in situ dans l'appendice vermiforme pour être incorporée par les parasites en cours de multiplication. Lors de l'abattage 4 échantillons d'appendice, d'iléon, de foie et de sang sont prélevés et la radioactivité comptée. La quantité totale d'uracile tritiée incorporée dans les différents organes est exprimée en cpm/poids total de l'organe (A), la concentration en cpm/g d'organe (B).


Invasion de l'organisme par les parasites marqués

      L'incorporation de l'uracile tritiée par les parasites a été très faible et une activité minimale est nécessaire pour pouvoir mettre en évidence des différences, tant en terme de mesure globale de la radioactivité dans les tissus, qu'en terme de détection des parasites marqués sur les coupes. En posant l'hypothèse que les parasites se disséminent de façon aléatoire dans tout l'organisme, l'injection d'un minimum de 5 µCi par lapin est nécessaire pour que la radioactivité potentiellement présente dans une coupe d'organe puisse être détectée (A. Le Pape, communication personnelle). Nous avons donc choisi de n'utiliser que les parasites ayant le taux d'incorporation de radioactivité le plus élevé, c'est-à-dire les oocystes produits par les lapins de l'essai n°2.

      Un essai a d'abord été réalisé sur 5 lapins avec une injection de 5 µCi par lapin ce qui correspond à une quantité de 2 x 107 oocystes. Les résultats de cet essai ne sont pas concluants : pour chaque organe la radioactivité mesurée dans les échantillons reste au niveau du bruit de fond quel que soit le délai de prélèvement après l'inoculation.

      L'expérimentation définitive a été effectuée sur 5 lapins. Des doses de 9,5 µCi, soit 4 x 107 oocystes, sont inoculées sous forme de sporocystes. Un lapin témoin est inoculé avec la même dose de sporocystes marqués, tués par chauffage, et est abattu 24 heures après l'inoculation ; ce témoin permet d'estimer la diffusion passive d'éléments marqués inertes. Les autres lapins sont sacrifiés à 6, 24, 36 et 70 heures après l'injection. Des échantillons d'organes (4 échantillons de 200 mg par organe) sont prélevés, lysés et la radioactivité est comptée au compteur-b à scintillation liquide. La moyenne des cpm des 4 échantillons extrapolée au poids total de l'organe permet d'estimer la distribution de la radioactivité dans l'organisme. La concentration de la radioactivité dans les différents organes, exprimée en cpm/mg d'organe, devrait être corrélée au nombre de parasites marqués par mg de tissu. Parallèlement à la mesure de la radioactivité, des coupes d'organes ont été réalisées, principalement sur l'intestin, la rate, les ganglions mésentériques et les poumons, pour vérifier la présence des parasites par immunohistochimie et pour détecter la radioactivité associée au parasite avec le b-Imager et par autoradiographie.


Répartition globale de la radioactivité dans les organes des lapins receveurs. Mesure au compteur-b à scintillation liquide

      La répartition de la radioactivité dans l'organisme (Fig. 24) montre une importante diffusion systémique du radiotraceur ou des dérivés tritiés (produits de dégradation, eau tritiée...). En effet, la quantité de radioactivité émise par le foie est de 5 à 20 fois plus élevée que celle de la plupart des organes et jusqu'à 100 fois plus élevée que celle de la rate. Jusqu'à 24 h.p.i., la radioactivité totale du duodénum est 2 à 3 fois plus importante que celle du reste de l'intestin. La radioactivité est élevée dans le foie, le rein et les poumons, alors qu'elle reste faible dans la rate et les ganglions mésentériques. Le bruit de fond, illustré par le lapin témoin, inoculé avec des sporocystes tués, est très important dans tous les organes. La comparaison avec le lapin inoculé avec les parasites vivants, sacrifié également 24 h.p.i., ne montre aucune différence significative ; seuls les ganglions mésentériques présentent une radioactivité supérieure à celle du lapin témoin. Globalement la quantité de radioactivité présente dans l'organisme tend à diminuer au cours du temps.

      

Fig. 24 : Répartition de la radioactivité dans les différents organes des lapins inoculés par voie intraduodénale avec des sporocystes. Les lapins sont inoculés par voie intraduodénale avec des sporocystes marqués à l'uracile tritiée. Les lapins sont inoculés avec 4 x 107 sporocystes ce qui correspond à 9,5 µCi. Ils sont ensuite sacrifiés à 6, 24, 46 et 72 h.p.i.. Le lapin témoin est inoculé avec la même quantité de sporocystes marqués tués par la chaleur et est sacrifié 24 heures après l'injection intraduodénale. Lors de l'abattage des prélèvements de différents organes sont effectués, digérés et la radioactivité comptée au compteur-ð à scintillation liquide. La distribution de la radioactivité dans les différents organes est exprimée en cpm/poids total de l'organe.

      La concentration de la radioactivité (Fig. 25) est particulièrement importante au cours des 24 premières heures au niveau du site d'injection, le duodénum, mais aussi de l'appendice puis tend à diminuer à partir de 46 h.p.i.. La radioactivité tissulaire est également importante 24 h.p.i. dans le foie et le thymus puis diminue au cours du temps. Le bruit de fond dans les organes du lapin témoin est fort et comparativement au lapin sacrifié au même temps (24 h.p.i.) on n'observe pas de différence.

      En conclusion de ces mesures, nous n'avons constaté aucune augmentation sensible et transitoire de la radioactivité émises par les différents organes.

      

Fig. 25 : Concentration de la radioactivité dans les différents organes des lapins inoculés avec des sporocystes marqués à l'uracile tritiée. Les lapins sont inoculés par voie intraduodénale avec des sporocystes marqués à l'uracile tritiée. La quantité de radioactivité injectée par lapin est de 9,5 µCi et correspond à une dose de 4 x 107 sporocystes. Les lapins sont sacrifiés à 6, 24, 46 et 72 h.p.i.. Le lapin témoin est inoculé avec la même quantité de sporocystes marqués tués par la chaleur et est sacrifié 24 heures après l'injection intraduodénale. Lors de l'abattage, des prélèvements de différents organes sont effectués, digérés et la radioactivité comptée au compteur-ð à scintillation liquide. L'adsorption de la radioactivité dans les différents organes est exprimée en cpm/mg d'organe.


Etude histologique de la répartition des parasites marqués dans les différents organes en fonction du temps

      Les coupes effectuées sur les organes prélevés ont été examinées en parallèle en immunohistologie, au b-Imager et en autoradiographie (Fig. 17, 18 et 26).


Distribution des parasites marqués avec des anticorps anti-sporozoïtes

      Le marquage immunohistologique des parasites sur les coupes d'organes a permis de confirmer que les sporozoïtes étaient infectants et migraient bien du duodénum vers l'appendice vermiforme (Fig. 17 et 18). La numération des parasites dans les tissus est donnée au chapitre B.1.1.1, p71 (Tab. 7B et Fig. 26) : on constate une diminution du nombre de parasites dans le duodénum parallèlement à un enrichissement de l'appendice. La densité dans l'appendice est maximale 70 h.p.i. et les premières mérogonies sont visibles dans les entérocytes (Fig. 17). Les parasites sont également observés dans l'iléon, les ganglions mésentériques et la rate avec un pic de densité 46 h.p.i..


Distribution des parasites marqués avec l'uracile tritiée : détection au b-Imager et par autoradiographie

      Les images obtenues par mesure de la radioactivité au b-Imager sont représentées ci-dessous (Fig. 26). La radioactivité par unité de surface est maximale 6 h.p.i. puis elle diminue de façon importante dès 24 h.p.i..

      Malgré plusieurs mois d'exposition d'émulsions photographiques au contact des coupes, aucun parasite marqué n'a pu être mis en évidence par autoradiographie.

      Le résultat global de l'étude histologique est que, quel que soit l'organe, il n'y a aucune corrélation entre le nombre de parasites et la radioactivité par mm2 de coupe.

      

Fig. 26 : Analyse de la répartition de la radioactivité dans les coupes des différents organes avec le b-Imager.

      Les expériences de radiomarquage du parasite n'ayant pas donné les résultats escomptés pour des raisons essentiellement méthodologiques, nous discuterons ici les résultats obtenus et nous n'y ferons plus référence dans la discussion scientifique de notre travail.

      Le marquage des Eimeria à l'uracile tritiée semblait judicieux puisque l'incorporation de cette base se fait spécifiquement dans les acides nucléiques du parasite et non dans ceux de la cellule hôte (Pfefferkorn et Pfefferkorn, 1977) ; cette caractéristique est utilisée pour quantifier le taux de multiplication des Eimeria in vitro (Schmatz et al., 1986 ; Hofmann et Raether, 1990 ; Dimier-Poisson et al., 1999). La multiplication des Eimeria du lapin étant actuellement impossible in vitro, les essais de marquage du parasite ont donc été réalisés in vivo. L'injection de l'uracile tritiée directement dans la lumière de l'appendice vermiforme, au contact des cellules épithéliales dans lesquelles se multiplient E. coecicola, nous a semblé une méthode pertinente compte-tenu des contraintes liées à l'utilisation in vivo des radioéléments.

      Notre 2ème essai de marquage avec des doses modérées de traceur, administrées en 2 fois, semblait prometteur mais la tentative d'amélioration a échoué. Certaines étapes de la technique ne sont pas totalement maîtrisables, notamment les éléments liés à l'acte chirurgical, à la ligature plus ou moins serrée de l'appendice et aux réactions postopératoires différentes selon les animaux.

      Après inoculation de sporocystes 'marqués', l'étude immunohistologique sur les différents organes a montré que l'invasion de l'organisme par les sporozoïtes est conforme à celle observée avec les parasites non marqués. Cependant, l'autoradiographie effectuée sur les mêmes coupes n'a pas permis de détecter de parasites marqués.

      Pour expliquer ces résultats plusieurs hypothèses peuvent être formulées. La plus plausible est que le radiotraceurs ou ses métabolites se soient adsorbés essentiellement sur les parois oocystales et sporocystales et accumulés dans les liquides interstitiels de l'oocyste. En effet, le simple broyage et rinçage des oocystes pour obtenir les sporocystes conduit à une diminution de la radioactivité d'un facteur 10. La présence d'uracile tritiée libre dans les liquides interstitiels et l'absence de fixation dans les acides nucléiques des parasites expliqueraient la concentration élevée de la radioactivité tout au long de l'intestin et dans les organes au cours des premières heures après l'inoculation. Elle serait due à l'absorption des liquides radioactifs par la muqueuse intestinale et à leur diffusion plasmatique. La radioactivité élevée mesurée dans l'appendice vermiforme 6 h.p.i. n'est pas due à la présence des parasites puisqu'ils ne sont pas encore arrivés dans cet organe ; elle serait plutôt liée, outre à l'absorption par la muqueuse, à une accumulation de débris de coques d'oocystes ou de membranes sporocystales dans le cul de sac qu'est l'appendice vermiforme.

      En conclusion, la méthode de marquage du parasite pourrait être améliorée. Une méthode in vitro serait préférable pour une meilleure maîtrise des paramètres de marquage. Cependant, le traceur à utiliser reste à déterminer. Les éléments s'incorporant dans la membrane plasmique comme le PKH26 inhibent le processus actif de pénétration des sporozoïtes. Le marquage avec un autre élément radioactif, l'indium111, inhibe les capacités de migration de l'élément infectant. Ce type de marquage s'accompagne, en effet, d'un relargage de la molécule chélatrice toxique dans le cytoplasme du parasite et le choc chimique subi est vraisemblablement incompatible avec sa survie. Le marquage au technétium99m, à l'indium111 avec une molécule chélatrice moins toxique, ou encore au chrome51, serait peut-être envisageable.


Invasion de l'organisme par E. intestinalis

      Eimeria intestinalis est l'espèce avec laquelle nous avons étudié la réponse immunitaire du lapin. Nous avons voulu vérifier que nos résultats sur l'invasion de l'organisme obtenus avec E. coecicola étaient applicables à cette espèce.


Migration d'E. intestinalis vers son organe cible


Inoculation intraduodénale

      Lapins naïfs

      Après l'injection des sporocystes, les sporozoïtes excystent et pénètrent in situ, dans les entérocytes du duodénum, en moins de 10 minutes. Une heure après l'inoculation les sporozoïtes se trouvent dans la lamina propria du duodénum. Une à 4 heures après l'inoculation, ils peuvent être observés dans la lamina propria de l'iléon et dans les entérocytes. Les parasites débutent leur première schizogonie 36 heures après l'inoculation dans les entérocytes des cryptes. Au cours de la phase invasive et jusqu'à 70 heures après l'inoculation, les parasites ne sont observés au niveau systémique, ni dans la rate, ni dans les ganglions mésentériques.

      Lapins immuns

      Chez des lapins primo-infectés per os puis inoculés par voie intraduodénale, très peu de sporozoïtes pénètrent dans la muqueuse duodénale. Ceux qui pénètrent restent sur place et ne migrent pas vers l'iléon.


Inoculation ex-situ

      Lapins naïfs

      Des essais d'inoculation extra-intestinale ont été réalisés afin de déterminer si les sporozoïtes pouvaient atteindre leur site de développement par la voie systémique.

      Des sporozoïtes d'E. intestinalis sont injectés par voie intraveineuse (2 x 107 sporozoïtes). Bien que les sporozoïtes soient détectés dans la rate 24 h.p.i., 48 h.p.i. nous n'avons pu les mettre en évidence ni au niveau extra-intestinal ni dans l'intestin (Tab. 12A). L'excrétion d'oocystes par des animaux inoculés avec des doses moins importantes de sporozoïtes (105 ou 5 x 105) est cependant détectable (respectivement 2,5x105 et 2,7x108) même si elle n'est pas maximale (£ 109 oocystes). Pour E. intestinalis, l'inoculation per os d'un seul oocyste (8 sporozoïtes) permet l'excrétion de 106 oocystes ; ainsi si certains sporozoïtes sont capables d'achever leur cycle ils représentent moins de 0,4% des parasites injectés.

      

Tab. 12 : Distribution des sporozoïtes d'E. intestinalis dans les organes des lapins après injection intraveineuse. 2 x 107 sporozoïtes sont injectés par voie intraveineuse à des lapins receveurs sacrifiés à 24 et 48 heures après l'injection (h.p.i.). La présence des sporozoïtes dans les différents organes est recherchée par marquage immunohistochimique sur coupes. Les résultats obtenus représentent le nombre moyen de sporozoïtes/coupe d'organe après examen de 12 coupes de 7 µm d'épaisseur. A : lapins naïfs ; B : lapins hyper-immunisés. 0 sporozoïte : - ; 1-5 : +/- ; 5-10 : + ; 10-20 : ++ ; 20-50 : +++ ; ³ 50 : ++++

      Des sporozoïtes d'E. intestinalis (2 x 107) ont été injectés dans l'appendice vermiforme ligaturé. Les sporozoïtes pénètrent en grand nombre dans la muqueuse mais ne sont pas retrouvés dans l'iléon dans les 40 heures qui suivent l'inoculation. Aucune figure de multiplication du parasite n'est observée dans l'appendice.

      Un mélange d'oocystes et de sporozoïtes a également été injecté par différentes voies (côlon, rectum, cavité péritonéale, utérus). Dans tous les cas les lapins ont excrété des oocystes ; la voie utérine est la plus efficace.

      Lapins immuns

      Des injections de sporozoïtes par voie intraveineuse à des lapins hyper-immunisés ont été réalisées afin de déterminer si davantage de parasites pouvaient terminer leur cycle chez ces animaux en évitant le passage par la muqueuse duodénale. Malgré les fortes doses injectées (2 x 107 sporozoïtes) pour permettre le suivi des parasites sur les coupes d'organes des animaux inoculés, ceux-ci ne sont retrouvés que dans la rate à 24 heures et en très faible nombre (Tab. 12B).

      Chez les animaux inoculés avec des doses plus faibles de 105 et 5 x 105 sporozoïtes, correspondant à une inoculation orale de 1,2 x 104 à 6 x 104 oocystes, aucune excrétion d'oocystes ne peut être détectée démontrant ainsi que l'évitement du duodénum n'empêche pas la réaction immunitaire.


Etude de la réponse immunitaire de l'hôte


Démarche expérimentale

      La plupart des Eimeria du lapin sont très immunogènes. Pour cette étude nous avons utilisé E. intestinalis, coccidie très pathogène et très immunogène qui se développe dans l'iléon.

      Sachant que chez les animaux 'immunisés' la protection se traduit par une absence totale de signes cliniques et d'excrétion d'oocystes, nous avons tout d'abord cherché à caractériser la réponse immune systémique et mucosale de ces animaux pour nous servir de référence et pour déterminer quels pouvaient être les mécanismes impliqués dans la protection. Dans un second temps, nous avons cherché à quel moment, au cours de l'infection primaire et des réinfections, ces mécanismes se mettaient en place.


Protocole expérimental

      Dans toutes les expérimentations concernant l'étude de l'immunité le même protocole a été utilisé et 3 lots de lapins ont été considérés : les lapins 'témoins' indemnes de coccidies, les lapins 'primo-infectés' et les lapins "immunisés".

      Les lapins "immunisés" sont inoculés per os à 5 semaines avec 1000 oocystes, puis à 15 jours d'intervalle, avec 5000 et 50000 oocystes. L'acquisition de l'immunité est évaluée par la mesure de l'excrétion d'oocystes du 7ème au 12ème jour après chaque inoculation.

      Quinze jours plus tard, les lapins immunisés et les lapins primo-infectés de même âge sont inoculés avec 1000 oocystes ; les lapins témoins restent non infectés tout au long de l'expérimentation. Le jour de l'inoculation des lapins primo-infectés est le jour J0 des expérimentations (Fig. 27).

      

Fig. 27 : Schéma expérimental d'immunisation des animaux et de suivi des populations lymphocytaires.

      Des animaux des 3 lots sont sacrifiés les jours J0, J3, J7, J14 et J21 suivant l'inoculation (8 à 10 lapins immunisés et primo-infectés, 4 lapins témoins par temps). Des animaux sont également sacrifiés en cours d'immunisation, le jour de la 2ème (J-30) et de la 3ème inoculation (J-15), ainsi que le 3ème (J-12) et le 7ème (J-7) jour après la 3ème inoculation, afin d'observer l'évolution des populations au cours de l'acquisition de l'immunité (Fig. 27).


Paramètres étudiés

      Une analyse descriptive et comparative de l'évolution des différentes populations lymphocytaires pan-T, CD4+ et CD8+, systémiques et locales, a été réalisée dans les 3 lots de lapins par cytométrie en flux et immunohistologie.

      Pour l'analyse des fluctuations des proportions de chaque population lymphocytaire, la rate, les ganglions mésentériques, le duodénum (site de pénétration du parasite dans l'intestin) et l'iléon (site de multiplication d'E. intestinalis) sont prélevés et des suspensions cellulaires préparées à partir de ces différents organes (Cf. § C, p49). Les lymphocytes sont marqués (Cf. § D.2, p53) et le pourcentage de chaque population est déterminé par analyse de la fluorescence par cytométrie en flux.

      Le marquage immunohistochimique des lymphocytes CD8+ sur des coupes d'intestin a eu pour objectif de préciser la localisation de ces cellules dans les villosités aux points importants de la cinétique d'évolution de cette population (Cf. § B.1.2.2 et B.1.2.3, p52).

      En complément de l'analyse de l'évolution des différentes populations, nous avons recherché à quel moment se met en place l'immunité fonctionnelle. Nous avons dosé les IgG sériques et réalisé des tests de transformation lymphoblastique (TTL) au cours de l'infection primaire. Des prises de sang et des prélèvements d'organes (rate et ganglions mésentériques) ont été réalisés aux jours J0, J3, J7, J14, J21 et J28. Les dosages des IgG et les TTL ont été réalisés comme décrit au chapitre F.


Résultats


Excrétion d'oocystes des animaux au cours des inoculations successives

      Les lapins désignés sous le terme de lapins "immunisés" ont été inoculés trois fois. La première inoculation avec 1000 oocystes d'E. intestinalis permet d'obtenir l'excrétion d'oocystes maximale, une dose supérieure à 2500 oocystes étant létale. L'excrétion est considérablement réduite après la seconde inoculation mais est encore détectable. Après la 3ème inoculation, les lapins sont considérés comme protégés contre E. intestinalis puisque leur excrétion d'oocystes n'est plus détectable même avec une dose inoculée 20 fois supérieure à la dose létale (Tab. 13).

      
Tab. 13 : Excrétion totale d'oocystes par lapin inoculé avec des doses croissantes d'oocystes d'E. intestinalis.
  1ère inoculation 2ème inoculation 3ème inoculation
Nombre d'oocystes inoculés excrétés inoculés excrétés inoculés excrétés
1000 3.108 ± 0,6.108 5000 6.104 ± 2.104 50000 nd

      Les lapins sont inoculés per os avec 1000 oocystes d'E. intestinalis, à l'âge de 5 semaines, puis avec 5000 et 50000 oocystes à 15 jours d'intervalle. L'excrétion d'oocystes est mesurée du 6ème au 12ème jour après chaque inoculation. Les résultats sont exprimés en moyenne de l'excrétion totale d'oocystes par lapin ± S.E.M..


Examen morphologique et dénombrement des cellules de la rate et des ganglions mésentériques

      Le poids et le nombre total de cellules de la rate et des ganglions mésentériques ont été mesurés au cours de l'infection primaire.

      Aucune splénomégalie n'est visible alors que le volume et le poids des ganglions mésentériques augmentent 14 jours p.i.. Ces observations ont été confirmées par les numérations de cellules :

  • aucune différence significative n'est observée dans le nombre de splénocytes entre les animaux infectés et témoins (environ 109 cellules tout au long de l'infection) ;
  • en revanche, le nombre total de cellules dans les ganglions mésentériques 14 jours p.i. est considérablement plus élevé (au-delà de 4 x 109 cellules) que celui des lapins témoins et des lapins infectés depuis 7 jours (109 cellules) (Fig. 28). Cette augmentation est transitoire et, 21 jours p.i., le nombre de cellules est redevenu comparable à celui d'un animal non infecté.

      

Fig. 28 : Evolution du nombre total de cellules dans les ganglions mésentériques après infection par E. intestinalis.

Les lapins sont inoculés per os avec 1000 oocystes d'E. intestinalis. Les ganglions mésentériques sont prélevés de 0 à 21 jours post-inoculation. Les cellules sont préparées par dilacération et comptées en cellule de Thoma. Les résultats sont exprimés en moyenne du nombre de cellules totales dans l'organe ± S.E.M..

Evolution des sous-populations lymphocytaires

      Les paramètres de fluorescence sont analysés sur la fenêtre d'acquisition correspondant aux paramètres morphologiques (FSC et SSC) des lymphocytes (rate et ganglions mésentériques Fig. 11 du Matériel et Méthodes ; duodénum et iléon Fig. 20). La fluorescence des cellules témoins incubées avec le conjugué seul (GAM-FITC- sans anticorps primaire) est mesurée pour chaque organe (rate, ganglions mésentériques, duodénum et iléon). Le seuil de fluorescence non spécifique est fixé à 10 pour le marquage des lymphocytes pan-T et à 20 pour les marquages des lymphocytes CD4+ et CD8+ (Fig. 12 du Matériel et Méthodes). Le pourcentage de chaque population lymphocytaire est ainsi déterminé pour chaque organe (Fig. 29).

      Pour les 4 organes dont les populations lymphocytaires ont été analysées, aucune évolution significative du nombre de lymphocytes pan-T n'a pu être mise en évidence au cours de l'infection primaire et des successives. La population des lymphocytes pan-T incluant les sous-populations CD4+ et CD8+, nous avons décrit et analysé les variations de ces 2 sous-populations. Les résultats concernant les lymphocytes pan-T ne sont donc pas présentés ici.

      

Fig. 29 : Analyse monoparamétrique de la fluorescence après simple marquage des lymphocytes pan-T, CD4+ et CD8+ dans différents organes.

Exemple de marquage des lymphocytes pan-T (notés CD5+), CD4+ et CD8+ dans A la rate, B les ganglions mésentériques, C le duodénum et D l'iléon. Les résultats sont exprimés en (nombre de lymphocytes marqués/nombre de lymphocytes analysés)% et correspondent aux pourcentages obtenus chez des lapins primo-infectés par E. intestinalis 14 jours après inoculation per os de 1000 oocystes.
Caractérisation du statut des animaux immuns

      Nous avons déterminé les caractéristiques des animaux 'immunisés' par comparaison avec des animaux témoins non infectés. Les lapins sont sacrifiés 14 jours après la 3ème inoculation de 50000 oocystes ce qui correspond à la fin de la période patente.

      Dans la rate et les ganglions mésentériques, on n'observe aucune différence dans les proportions de lymphocytes CD4+ et CD8+ entre les animaux immunisés et témoins (Tab. 14).

      Dans l'intestin, la proportion de lymphocytes CD4+ n'est pas significativement différente de celle des lapins témoins. En revanche, la proportion de lymphocytes CD8+ est significativement plus élevée chez les lapins immunisés (Tab. 14), environ 3 fois celle des lapins témoins.

      
Tab. 14 : Proportions des lymphocytes T-CD4+ et T-CD8+ dans la rate et les ganglions mésentériques d'animaux immunisés contre E. intestinalis.
Organes % CD4+ % CD8+
Témoins Immunisés Témoins Immunisés
Rate 17.4 ± 1.7 17.2 ± 2.6 9.1 ± 1.1 8.1 ± 0.3
Ganglions Mésentériques 43.2 ± 2.2 43.8 ± 1 8.8 ± 0.9 8.5 ± 0.5
Duodénum 1.3 ± 0.3 3.5 ± 0.7 10.4 ± 1 30.9 ± 1.9 a
Iléon 4.3 ± 1.8 4.5 ± 1.3 7.9 ± 2 24.2 ± 2.9 b

a b Test de Tukey significatif pour a p < 0,001 b p < 0,01. Les lapins immunisés sont sacrifiés 14 jours après la 3ème inoculation de 50000 oocystes, au même âge que les animaux témoins. Les lymphocytes T CD4+ et CD8+ de la rate, des ganglions mésentériques, du duodénum et de l'iléon sont marqués respectivement avec les anticorps monoclonaux MCA799 et MCA1576. Les proportions de ces 2 sous-populations sont déterminées par cytométrie en flux.

      Evolution des proportions des différentes populations lymphocytaires au cours de l'infection primaire.

      Dans un second temps nous nous sommes intéressés à la cinétique d'évolution des proportions de lymphocytes CD4+ et CD8+ au cours de l'infection primaire. Les lapins de 11 semaines sont inoculés avec 1000 oocystes d'E. intestinalis le jour J0 de l'expérimentation et sacrifiés à J0, J3, J7, J14 et J21.

      Dans la rate, aucune évolution des proportions de lymphocytes CD4+ et CD8+ n'est mise en évidence au cours de la primo-infection.

      Dans les ganglions mésentériques, la proportion des lymphocytes CD4+ (autour de 43%) ne présente pas de variation significative par rapport aux lapins non infectés (Fig. 30A). En revanche, à partir de 7 jours p.i., le pourcentage de lymphocytes CD8+ augmente et la différence devient significative (p < 0,01) 14 jours p.i. (Fig. 30B) ; cette augmentation est transitoire puisque, 21 jours p.i., la proportion revient à son niveau initial.

      

Fig. 30 : Evolution des proportions des lymphocytes CD4+ et CD8+ dans les ganglions mésentériques et l'intestin des lapins au cours de l'infection primaire par E. intestinalis.

A, B : Ganglions Mésentériques (GM) ; C, D : Duodénum ; E, F : Iléon. Test de Tukey significatif pour * p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001. Les lapins sont inoculés avec 1000 oocystes d' E. intestinalis. Les ganglions mésentériques, le duodénum et l'iléon sont prélevés aux temps post-inoculation indiqués. Les lymphocytes sont marqués avec des anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs de surface CD4 et CD8. et analysés par cytométrie en flux. Les résultats sont exprimés en moyenne des (nombre de lymphocytes marqués / nombre de lymphocytes totaux analysés)% ± S.E.M.. L'analyse statistique utilisée est un test de Tukey sur les valeurs transformées (ASIN (%1/2)).

      Dans l'intestin, 14 jours après l'inoculation primaire, le pourcentage de lymphocytes CD4+ augmente significativement dans le duodénum et l'iléon (p < 0,001 ;Fig. 30C, E) et persiste au-delà de 21 jours p.i. (p < 0,01) dans le duodénum uniquement. Le pourcentage de lymphocytes CD8+ augmente également fortement à partir du 14ème jour p.i., à la fois dans le duodénum et l'iléon (Fig. 30D, F). Cette augmentation est hautement significative 14 jours p.i. (p < 0,001) et se maintient 21 jours p.i. (p < 0,001 dans l'iléon et p < 0,05 dans le duodénum), se prolongeant ainsi plus longtemps que dans le cas des lymphocytes CD4+.


Evolution des proportions des différentes populations lymphocytaires au cours des inoculations successives.

      Nous avons ensuite cherché à déterminer comment évoluent les pourcentages de lymphocytes CD4+ et CD8+ au cours des infections successives chez les lapins en cours d'immunisation. Des animaux ont été sacrifiés 15 jours après la 1ère et la 2ème inoculation (J-30 et J-15), les 3ème et 7ème jours suivant la 3ème inoculation (J-12 et J-7) puis les 3ème, 7ème, 14ème et 21ème jours suivant l'inoculation d'épreuve pratiquée à J0 (Fig. 27).

      

Les lapins sont inoculés 3 fois à 15 jours d'intervalle aux jours -45, -30 et -15 avec des doses croissantes de 1000, 5000 et 50000 oocystes d' E. intestinalis et reçoivent une inoculation d'épreuve de 1000 oocystes le jour J0 correspondant au jour d'inoculation des lapins primo-infectés. La rate est prélevée aux temps indiqués. Les lymphocytes sont marqués avec des anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs de surface CD4 et CD8 et analysés par cytométrie en flux. Les résultats sont exprimés en moyenne du rapport (nombre de lymphocytes marqués / nombre de lymphocytes totaux analysés)% ± S.E.M.. L'analyse statistique utilisée est un test de Tukey sur les valeurs transformées (ASIN (%1/2)). Test de Tukey significatif pour * p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001.

      Dans la rate, les pourcentages varient d'un jour d'expérimentation à l'autre (Fig. 31). Cependant, ces variations touchent de la même façon les animaux témoins et immunisés, les différences entre les 2 lots ne sont pas significatives.

      Dans les ganglions mésentériques, au cours des inoculations successives la proportion de lymphocytes CD4+ reste stable, entre 40 et 45% (Fig. 32A). De même, la proportion de lymphocytes CD8+ varie peu (Fig. 32B). Cependant, 14 jours après la 1ère inoculation, le pourcentage de cellules CD8+ chez les animaux inoculés est plus élevé que celui des témoins. La différence entre les 2 lots n'est pas significative du fait du petit nombre d'animaux utilisés (2 par lot) mais ce résultat est conforme à ce qui a été observé au cours de l'infection primaire de lapins plus âgés (Fig. 30B).

      Au niveau intestinal, 14 jours après la 1ère inoculation (J-30), on peut constater une augmentation du pourcentage de lymphocytes CD4+ (Fig. 32C et E). Cette différence est significative dans le duodénum uniquement (p < 0,05) du fait du petit nombre d'animaux utilisé (2 par lot) mais confirme ce qui a été observé chez les animaux primo-infectés plus âgés (Fig. 32 et Fig. 30, C et E). La proportion de lymphocytes CD8+ augmente également considérablement (Fig. 32D et F) passant d'environ 10% chez les animaux témoins à plus de 25% chez les animaux en cours d'immunisation (p < 0,05 dans le duodénum). Quatorze jours après la seconde inoculation (J-15), le taux de lymphocytes CD8+ diminue. En revanche, la 3ème inoculation provoque un nouvel afflux de ces cellules beaucoup plus précocement qu'après l'infection primaire (dès 3 jours après l'inoculation, J-12). L'inoculation, 15 jours plus tard, de 1000 oocystes (J0) n'induit pas de recrutement supplémentaire des lymphocytes CD8+.

      

Fig. 32 : Evolution des proportions des lymphocytes CD4+ et CD8+ dans les ganglions mésentériques et l'intestin des lapins au cours des inoculations successives avec E. intestinalis.

A, B : Ganglions Mésentériques (GM) ; C, D : Duodénum ; E, F : Iléon. Les lapins sont inoculés ( ) avec E. intestinalis 3 fois à 15 jours d'intervalle, aux jours -45 (1000 oocystes), -30 (5000 oocystes) et -15 (50000 oocystes). Les lapins reçoivent une inoculation d'épreuve de 1000 oocystes le jour J0. Les ganglions mésentériques, le duodénum et l'iléon sont prélevés aux temps indiqués. Les lymphocytes sont marqués avec des anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs de surface CD4 et CD8 et analysés par cytométrie en flux. Les résultats sont exprimés en moyenne du rapport (nombre de lymphocytes marqués / nombre de lymphocytes totaux analysés)% ± S.E.M.. L'analyse statistique utilisée est un test de Tukey sur les valeurs transformées (ASIN (%1/2)). Test de Tukey significatif pour * p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001.

Localisation intestinale des lymphocytes CD8+

      Seul le marquage des lymphocytes CD8+ est assez puissant pour être observé en microscopie à fluorescence. Nous avons ainsi pu visualiser les changements dans la distribution de cette population lymphocytaire dans l'intestin (Fig. 33).

      

Fig. 33 : Distribution des lymphocytes CD8+ dans des coupes d'intestin après une infection primaire par E. intestinalis.

Les lapins sont infectés avec 1000 oocystes d'E. intestinalis A-B coupes réalisées 7 jours p.i., C-D 14 jours p.i. et E-F 21jours p.i.. A-C-E : coupes de duodénum et B-D-F : coupes d'iléon. Grossissement x 600.

      Chez les lapins témoins non infectés et les lapins infectés depuis 7 jours, les lymphocytes CD8+ sont peu nombreux et se trouvent en position intra-épithéliale. Le 14ème jour p.i. d'importantes infiltrations de lymphocytes CD8+ sont observées dans la lamina propria du duodénum et de l'iléon des lapins infectés. Le 21ème jour p.i. les lymphocytes CD8+ sont encore présents en grand nombre et en position intra-épithéliale, comme chez les lapins immunisés.


Mesure de la prolifération des leucocytes par incorporation de thymidine tritiée


Prolifération non spécifique en présence de Concanavaline A

      La prolifération non spécifique des lymphocytes de la rate et des ganglions mésentériques a été testée en présence de concanavaline A (ConA) dans le milieu de culture.

      Des essais ont été réalisés avec soit 5 soit 10 µg/ml de ConA. Les résultats obtenus avec 10 µg/ml n'étant pas significativement supérieurs à ceux obtenus avec 5 µg/ml, les expériences ont, par la suite, toujours été réalisées avec 5 µg/ml.

      Chez tous les animaux testés une prolifération non spécifique des cellules de ganglions mésentériques a été mise en évidence (Tab. 15). Les cellules du lot témoin prolifèrent légèrement moins que celles des lots primo-infectés et immunisés mais la différence n'est pas significative. La capacité des cellules à proliférer, au cours des 28 jours suivant l'inoculation primaire, n'est pas modifiée.

      
Tab. 15 : Prolifération non spécifique des cellules de ganglions mésentériques et de la rate chez les animaux témoins, primo-infectés et immunisés avec E. intestinalis.
  Témoins Primo-infectés Immunisés
  T ConA T ConA T ConA
GM 721 ± 196 75893 ± 5330 913 ± 136 86208 ± 3955 538 ± 145 89278 ± 10916
Rate 3023 ± 322 102685 ± 12282 3787 ± 325 68011 ± 6967 2916 ± 418 77449 ± 11204

Les animaux primo-infectés et immunisés reçoivent 1000 oocystes d'E. intestinalis le jour J0 de l'expérimentation. Les lymphocytes sont isolés des ganglions mésentériques (GM) et de la rate les jours J0, J3, J7, J14, J21 et J28 et incubés 3 jours en présence de 5 µg/ml de concanavaline A (ConA). la prolifération est mesurée par le taux d'incorporation de 3[H]-Thymidine au cours des 6 dernières heures d'incubation. Les résultats donnés représentent les moyennes des cpm de tous les animaux d'un même lot aux différents temps testés et sont exprimés en moyenne des cpm ± S.E.M. T : cellules en culture pendant 3 jours dans du milieu seul ; ConA : cellules en culture pendant 3 jours en présence de Concanavaline A à 5 µg/ml.

      Une prolifération non spécifique a également été obtenue avec les splénocytes, à tous les temps testés, et pour les 3 lots d'animaux (Tab. 15). La prolifération non spécifique des cellules issues des animaux témoins est toujours légèrement supérieure à celle des cellules issues des animaux immunisés et primo-infectés ; la différence entre les lots témoin et primo-infecté est légèrement significative (p < 0,05). Cependant, la moyenne des cpm obtenue pour le lot des lapins primo-infectés est très élevée et on n'observe pas de modification de la capacité à proliférer des cellules spléniques au cours de la primo-infection.


Prolifération spécifique en présence d'extraits parasitaires

      La prolifération spécifique a été testée et mise au point avec des lymphocytes de lapins immuns. Des essais avec des doses de 5 et 10 µg/ml d'antigènes parasitaires, et avec un milieu de culture, contenant 2,5% de sérum de lapereau ou 10% de sérum de veau foetal ont été réalisés. Les meilleurs résultats étant obtenus avec 10 µg/ml d'antigènes parasitaires et avec le milieu contenant 2,5% sérum de lapin, tous les résultats présentés ici ont été obtenus dans ces conditions expérimentales.


Chez les animaux immunisés

      Chez les lapins immunisés, 14 jours après la 3ème inoculation, on observe une importante prolifération spécifique à la fois des cellules spléniques et des cellules de ganglions mésentériques (Tab. 16).

      
Tab. 16 : Prolifération, en présence d'extrait parasitaire, des splénocytes et des cellules de ganglions mésentériques chez des lapins immunisés avec E. intestinalis.
  Dcpm
Témoins Immunisés
Rate 414 ± 414 54434 ± 14130a
Ganglions mésentériques 161 ± 161 64418 ± 15224b

Les lapins immunisés ont été inoculés 3 fois à 15 jours d'intervalle avec des doses croissantes d'oocystes et sacrifiés 14 jours après la 3ème inoculation. Les leucocytes de la rate et des ganglions mésentériques sont isolés et incubés pendant 5 jours en présence d'antigènes parasitaires à 10 µg/ml. La prolifération est mesurée par le taux d'incorporation de 3[H]-Thymidine au cours des 6 dernières heures d'incubation. Les résultats sont exprimés en moyenne des Dcpm (cpm/puits avec Ag - cpm/puits témoins) ± S.E.M.. a, b Test de Student significatif pour p < 0,01.

Chez les animaux primo-infectés

      Nous avons cherché à déterminer à quel moment de l'infection l'immunité spécifique se met en place dans la rate et les ganglions mésentériques. Nous avons réalisé 6 tests de lymphoprolifération au cours des 28 jours suivant l'infection primaire.

      Les cellules spléniques, ne prolifèrent pas jusqu'à 21 jours p.i. (Fig. 34). Le 28ème jour p.i., les cellules de 2 lapins sur 3 prolifèrent de façon significative en présence d'antigènes parasitaires.

      Fig. 34 : Prolifération, en présence d'extraits parasitaires, des splénocytes et des cellules de ganglions mésentériques chez des lapins primo-infectés avec E. intestinalis.

      

A : Rate ; B : Ganglions mésentériques Les lapins sont inoculés avec 1000 oocystes d'E. intestinalis. Les leucocytes sont isolés aux temps post-inoculation indiqués et incubés pendant 5 jours en présence de 10 µg/ml d'antigènes parasitaires. La prolifération est mesurée par le taux d'incorporation de 3[H]-Thymidine au cours des 6 dernières heures d'incubation. Les résultats sont exprimés en moyenne des Dcpm (cpm/puits avec Ag - cpm/puits témoins) ± S.E.M.. * Test de Student significatif pour p < 0,05.

      En revanche, les lymphocytes des ganglions mésentériques des lapins infectés prolifèrent considérablement (50 fois plus) par rapport aux témoins (Fig. 34). Cette prolifération est détectable dès 7 jours p.i., devient significative 14 jours p.i., et augmente encore jusqu'à 28 jours p.i..


Dosage des IgG sériques

      La production d'IgG sériques a d'abord été testée sur les lapins immunisés. La présence des IgG dans les sérums est recherchée avec un test ELISA. Le titre est défini comme l'inverse de la plus grande dilution pour laquelle la densité optique est au moins égale à 2,5 fois celle d'un sérum témoin à la même dilution, et est exprimé en log2.

      Quatorze jours après la 3ème inoculation le titre en anticorps exprimé en log2 est de 80 ± 11,5.

      Au cours de la primo-infection, la détection des IgG sériques permet de tester la mise en place de la réponse systémique. Le titre en IgG augmente entre 7 et 14 jours p.i. (Fig. 35) puis plus faiblement jusqu'à 21 jours p.i. ; cependant, il reste 40 fois inférieur à celui des lapins immunisés.

      

Fig. 35 : Titres en IgG sériques des lapins primo-infectés et immunisés avec E. intestinalis.

Les lapins infectés reçoivent 1000 oocystes d'E. intestinalis le jour 0. La présence des IgG dans le sérum est recherchée avec un test ELISA Le titre obtenu avec les lapins immunisés est donné comme référence. Ces animaux ont été inoculés 3 fois à 15 jours d'intervalle avec des doses croissantes d'oocystes d'E. intestinalis. Le titre donné est celui obtenu 14 jours après la 3ème inoculation lorsque l'excrétion d'oocystes de ces lapins n'est plus détectable. Les résultats sont exprimés en moyenne des titres des lapins du lot ± S.E.M..

DISCUSSION


Etude du cycle parasitaire

      Des études préalables portant sur les cycles parasitaires de plusieurs Eimeria ont permis de mettre à jour des particularités propres au développement de ces parasites chez le lapin. A partir de ces constatations une hypothèse a été formulée : le sporozoïte, élément parasitaire infectant, pénètre au niveau du duodénum et est transporté jusqu'à son site de développement par les lymphocytes via un trajet extra-intestinal (Pakandl et al., 1995). Le premier objectif de notre étude était de vérifier cette hypothèse.

      Notre travail a essentiellement porté sur E. coecicola qui constitue un bon modèle d'étude. En effet, compte tenu de la distance et du temps nécessaire à la migration des sporozoïtes du duodénum jusqu'à l'appendice vermiforme d'une part, et de la division du parasite dans des cellules de type lymphoïde d'autre part, l'hypothèse d'un trajet extra-intestinal via les lymphocytes était particulièrement vraisemblable pour cette espèce d'Eimeria. De plus, le temps nécessaire à la migration est suffisamment long par rapport à celui des autres espèces pour permettre la mise en évidence d'une éventuelle phase extra-intestinale.


Présence extra-intestinale de sporozoïtes invasifs d'E. coecicola

      Le marquage des parasites sur des coupes d'organes a permis, dans un premier temps, de confirmer les résultats obtenus en microscopie électronique. Les parasites sont très rapidement observés dans la lamina propria du duodénum, apparaissent dans la lamina propria de l'appendice vermiforme à partir de 24 h.p.i., et la première schizogonie débute 65 h.p.i.. La migration du parasite, depuis la muqueuse duodénale jusqu'à l'organe cible, s'étale sur 1 à 3 jours.

      Nous avons démontré qu'au cours de la phase invasive le parasite n'est pas confiné dans l'intestin. On le trouve, vivant et infectant, dans le sang périphérique et différents organes comme la rate et les ganglions mésentériques. Ce résultat est en accord avec ce qui a été observé chez le poulet après infection expérimentale per os (Kogut et Long, 1984 ; Al-Attar et Fernando, 1987 ; Fernando et al., 1987 ; Perry et Long, 1987).

      La période prépatente est raccourcie chez les lapins receveurs inoculés avec des préparations d'appendice, et ceci d'une durée égale à celle du développement antérieur du parasite chez le lapin donneur. Ainsi, comme chez le poulet, le sporozoïte est le stade parasitaire présent au niveau extra-intestinal puisque la période prépatente chez l'animal receveur est de 8 jours, alors que dans les cellules de l'appendice vermiforme issues de lapins infectés depuis 65 h.p.i., à la fois des sporozoïtes (excrétion à partir de 8 jours p.i.) et des mérozoïtes (excrétion à partir de 7 jours p.i.) sont présents.

      Dans nos expériences, nous avons pu constater des variations dans l'excrétion parasitaire des lapins receveurs en fonction du tissu inoculé. Ainsi, les excrétions d'oocystes obtenues par transfusion de sang ou transfert de leucocytes sanguins ont été faibles par rapport à celles obtenues après transfert de cellules de rate ou de ganglion mésentérique. Cependant, l'estimation des taux d'infection des différents tissus et organes par mesure des excrétions d'oocystes obtenues chez les animaux receveurs serait osée. En effet, dès que le nombre d'oocystes inoculés dépasse 400, l'excrétion atteint un plateau (environ 108 oocystes) et n'est donc plus corrélée au nombre de parasites inoculés. Dans notre étude, nous n'avons donc pas pu mettre en évidence de différence significative dans le taux d'infection des différents organes testés. Chez le poulet, cette comparaison a parfois été possible. Ainsi, Kogut et Long (1984), ont obtenu une excrétion chez les poulets receveurs inoculés avec le sang, le foie, le coeur, les poumons, mais pas avec la rate, d'animaux donneurs infectés avec un mélange d'Eimeria. De même, l'infection par E. necatrix, E. acervulina, E. brunetti, E. maxima ou E. praecox peut être transférée à partir de l'intestin, du foie et de la rate des animaux donneurs, mais de façon moins importante à partir du sang et des reins (Al-Attar et Fernando, 1987).

      Les études réalisées en immunohistochimie tendraient à démontrer l'existence d'une phase de dissémination extra-intestinale du parasite, maximale 48 h.p.i.. Cependant, la chronologie d'invasion des différents organes n'a pu être mise en évidence ni par immunohistochimie ni par transfert de cellules. En effet, dans ces expériences dès 15 h.p.i. tous les organes testés étaient parasités ; la séquence des événements, donc l'organe infecté en premier, n'ont pu être déterminés. Chez le poulet, Fernando et al. (1987) ont montré que les parasites sont présents dès 3 h.p.i. dans le sang et différents organes de l'hôte et que la densité parasitaire au niveau extra-intestinal est maximale dans les premières heures suivant l'infection. Ces résultats expliqueraient pourquoi, 4 jours après l'inoculation, Kogut et Long (1984) n'ont pu observer la présence de parasites dans la rate.

      Malgré la synchronisation du cycle parasitaire d'E. coecicola induite par l'inoculation intraduodénale, des parasites sont encore présents dans le duodénum, ainsi qu'au niveau extra-intestinal, chez les animaux donneurs 65 h.p.i. alors qu'au même moment la première mérogonie débute dans l'appendice vermiforme. La présence de ces parasites est peut-être due à un trop grand nombre de parasites inoculés par rapport au nombre de cellules vectrices et/ou au fait que les parasites retardés n'ont plus la capacité de migrer (Lawn et Rose, 1982). L'inoculation expérimentale de fortes doses d'oocystes, 1,5 x 105 à 2 x 107 oocystes, (Al-Attar et Fernando, 1987 ; Fernando et al., 1987) peut également placer l'hôte dans des conditions d'hyperparasitisme et provoquer la dissémination du parasite dans des sites atypiques. Dans le cas d'une infection par E. stiedai, Fitzgerald et al. (1974) ont montré en réalisant des transfusions que le parasite est encore présent et infectant dans le sang des lapins 27 jours p.i.. La présence extra-intestinale du parasite longtemps après la fin du cycle parasitaire fait penser qu'il s'agit, dans ce cas, d'une impasse biologique pour celui-ci. Ainsi, le flux de parasites observé dans les organes est-il lié à la migration du parasite ou à son élimination progressive par l'organisme ? L'existence d'une forme de latence des parasites dans l'organisme de l'hôte a également été évoquée (Landau, 1973).

      Chez le lapin infecté par E. coecicola nous n'avons pas mis en évidence de formes de multiplication parasitaire en dehors du GALT contrairement à ce qui a été montré chez d'autres espèces animales (Lotze et al., 1964 ; Lima, 1979). Cependant, une dissémination extra-intestinale du parasite est observée et nous possédons de nombreux arguments indirects en faveur d'un trajet extra-intestinal :

      L'hypothèse du passage des parasites par la voie lymphatique est fortement renforcée par nos observations de parasites dans les ganglions mésentériques. Cette hypothèse a également été formulée par Horton (1967) dans le cas de l'infection par E. stiedai ; les parasites sont là aussi observés dans les ganglions mésentériques à partir de 16 h.p.i. et leur densité dans cet organe maximale 30 h.p.i..


Evitement possible de la voie luminale

      D'autres arguments en faveur de l'existence d'une phase extra-intestinale nous ont été donnés par les expériences d'inoculation de parasites par voie parentérale. En effet, toutes les expérimentations consistant à injecter des sporozoïtes, des sporocystes et même des oocystes par voie parentérale (IV, IM, IP) ou ex situ (côlon, rectum, utérus) ont abouti au développement des parasites jusqu'à l'excrétion d'oocystes. Ainsi, la voie luminale n'est pas nécessaire au parasite pour atteindre son site de développement. Ceci est également vrai pour E. intestinalis.

      De nombreux travaux réalisés chez le rat, le poulet ou le lapin ont montré le tropisme des différentes formes parasitaires pour leur site spécifique de développement après inoculation parentérale (Landers, 1960 ; Sharma et Reid, 1962 ; Sharma, 1964 ; Long et Rose, 1965 ; Pellérdy, 1969). L'injection sous-cutanée (SC), IM, IP, et IV d'oocystes sporulés et de sporozoïtes d'E. tenella conduit au développement d'une coccidiose cæcale (Sharma et Reid, 1962). De même, l'inoculation SC d'oocystes sporulés d'E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. tenella, E. brunetti, E. mitis et E. praecox permet d'obtenir le développement des parasites au niveau de leur site spécifique dans l'intestin du poulet (Sharma, 1964). Lorsque des oocystes sont injectés par voie parentérale, les sporozoïtes doivent être libérés de la coque oocystale et des sporocystes pour parvenir à leur site de développement. Des travaux réalisés avec E. nieschulzi ont montré que l'excystation des oocystes pouvait se produire dans le muscle, dans les veines, ainsi que dans la cavité péritonéale chez le rat (Landers, 1960). De même, Sharma (1964) a pu observer sur des poulets que, dans les 2 heures suivant une injection d'oocystes par voie IV, des oocystes intacts, des coques vides et des sporocystes sont présents dans les poumons, de même qu'au site d'injection après inoculation IM.

      Dans tous ces travaux, si les différentes voies d'inoculation parentérale permettent l'aboutissement du cycle parasitaire, elles ne sont cependant pas aussi efficaces que la voie orale (Sharma et Reid, 1962 ; Sharma, 1964 ; Long et Rose, 1965 ; Abu Ali et al., 1976 ; Perry et Long, 1987).

      Dans notre étude, les sporozoïtes inoculés ex situ dans le côlon et le rectum ont induit des excrétions d'oocystes relativement faibles. Cependant, l'observation d'oocystes dans l'appendice vermiforme a démontré que le parasite s'est développé au niveau de son site spécifique et pas uniquement dans les tissus lymphoïdes diffus associés au côlon et au rectum. La multiplication des parasites dans l'appendice vermiforme renforce également l'hypothèse de l'existence d'une voie extra-intestinale. En effet, le passage des sporozoïtes du rectum à l'appendice par voie luminale, via le cæcum, est très peu probable. Cependant, chez le poulet, des travaux réalisés avec E. praecox ont montré qu'un petit nombre de sporozoïtes inoculés dans le cæcum peut remonter jusqu'au haut de l'intestin grêle où il se développe (Long, 1967 ; Long et Millard, 1976). Les parasites ne sont pas retrouvés au niveau extra-intestinal et la migration semble se faire par la voie luminale.

      Dans nos expériences, parmi les voies d'inoculation parentérale, la voie intramusculaire a été, comparativement aux autres, la moins efficace. Cette même constatation a été faite par Long et Rose (1965) dans leurs travaux avec E. tenella : l'injection SC ou IM de 5,4 x 105 sporozoïtes ne permet pas la production d'oocystes contrairement à l'injection IP ou IV qui est la voie d'inoculation la plus efficace. Ce n'est pas ce que nous avons observé avec E. coecicola chez le lapin. En effet, l'inconvénient majeur de l'injection IV est l'arrivée quasi immédiate des parasites au niveau des poumons. Ceux-ci constituent un véritable filtre dans lequel sont retenus les parasites (observations personnelles ; Sharma, 1964). Ainsi, 7 jours après l'inoculation, des oocystes peuvent encore être retrouvés à ce niveau mais n'ont cependant plus la capacité d'induire une infection chez des animaux sensibles (Sharma, 1964).

      Parmi les voies d'inoculation testées chez le lapin, la voie utérine s'est avérée être la voie d'inoculation la plus efficace. D'autres études ont déjà montré, dans des cas d'infections naturelles, la présence de formes parasitaires asexuées et sexuées d'Eimeria dans le tractus génital femelle (McCully et al., 1967 et 1970). Il est possible que l'environnement de l'utérus soit propice à la survie du parasite du fait de la présence d'un épithélium et d'une muqueuse dont la structure diffère peu de celle de l'intestin, malgré son origine embryonnaire différente. Le déclenchement d'une inflammation après l'injection pourrait permettre le recrutement des lymphocytes dans la muqueuse richement irriguée en vaisseaux sanguins et lymphatiques ; la recirculation de ces lymphocytes pourrait aisément amener les parasites à la muqueuse intestinale, les systèmes d'adressines vasculaires étant en partie similaires et les 2 systèmes lymphoïdes interconnectés (Brandtzaeg et al., 1999).

      Nos résultats nous ont ainsi amenés à considérer la notion de tropisme du sporozoïte vers son site de développement. En effet, après injection IV, nous avons constaté que, dans l'appendice vermiforme, la densité parasitaire augmente au cours du temps. Cet enrichissement en parasites du site spécifique est en faveur du tropisme. De plus, bien que la plupart des voies parentérales testées soient moins efficaces que la voie d'inoculation per os, l'inoculation intra-utérine de doses faibles de parasites a permis d'obtenir des excrétions d'oocystes élevées, identiques à celles obtenues avec l'inoculation du même nombre de parasites par voie intraduodénale. Cette constatation tend à prouver que la plupart des sporozoïtes injectés sont arrivés à destination et serait donc en faveur d'un véritable déterminisme dans le trajet du parasite à travers l'organisme de l'hôte.

      Nous avons également montré qu'après inoculation IV les sporozoïtes arrivent dans l'appendice vermiforme entre 24 et 65 h.p.i., c'est-à-dire dans le même délai qu'après inoculation intraduodénale. De plus, quelle que soit la voie d'inoculation utilisée, nous n'avons pas constaté d'allongement de la période prépatente. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Sharma (1964) sur le poulet. Il semblerait donc que, soit les parasites arrivent à l'organe cible dans le délai normal et peuvent se développer, soit ils sont retardés et perdent cette capacité (Sharma, 1964). Cependant, d'autres travaux comme ceux de Patnaik (1966) avec E. tenella et ceux de Pellérdy (1969) avec E. stiedai ont montré qu'il était possible d'observer un retard de 2 à 3 jours dans l'excrétion après inoculation parentérale d'oocystes.

      Toutes nos expériences n'ont pas exclu définitivement la possibilité pour le parasite de passer par la voie luminale au cours de l'invasion dans les conditions naturelles. Cependant, nous avons démontré que la voie luminale n'est pas indispensable pour que le parasite atteigne son site de développement et accomplisse tout son cycle. La présence extra-intestinale du parasite infectant, en particulier dans les organes lymphoïdes, renforce notre hypothèse et suggère que le parasite pourrait atteindre son site de développement en empruntant la voie lymphatique puis sanguine de recirculation des lymphocytes.

      Les travaux réalisés avec E. intestinalis n'ont pas permis, en revanche, de démontrer la présence extra-intestinale du parasite au cours de sa phase invasive très courte (moins de 2 heures). Il est possible que la migration soit trop fugace, mais les fortes quantités parasitaires utilisées rendent peu probable cette hypothèse. Il est également possible que la migration soit limitée au réseau capillaire intestinal. Dans tous les cas, la voie luminale n'est pas, là non plus, nécessaire à la réalisation du cycle.


Cellules hébergeant le parasite au cours de la phase invasive

      Après avoir démontré la présence de parasites dans différents organes de l'hôte au cours de l'invasion, nous avons essayé de déterminer quel(s) type(s) cellulaire(s) hébergeaient les sporozoïtes dans le duodénum et l'appendice vermiforme. Les sporozoïtes ayant déjà été décrits dans des cellules de type lymphoïde (Pakandl et al., 1993), nous avons recherché leur présence dans les lymphocytes B (IgM+) et pan-T isolés par tri cellulaire. Cette technique a permis l'obtention de populations cellulaires à un haut degré de pureté. La présence de parasites dans les lymphocytes a également été recherchée en microscopie électronique (Renaux et al., 2001).

      Les injections intraveineuses de lymphocytes triés à des lapins indemnes de coccidies ont montré que les sporozoïtes étaient vivants et infectants à la fois dans les lymphocytes B et dans les lymphocytes T du duodénum et de l'appendice vermiforme. Ces résultats ne permettent pas de préjuger de la voie empruntée par les lymphocytes parasités jusqu'à l'organe cible. En effet, bien que les animaux donneurs et receveurs soient homozygotes pour les gènes de classe II du CMH, il est probable que les lymphocytes triés injectés soient détruits, et que les parasites libérés soient pris en charge par des cellules du receveur. Cependant, quel que soit le sort des lymphocytes des lapins donneurs, l'excrétion d'oocystes par les lapins receveurs prouve qu'au moment du tri les parasites étaient encore vivants dans les lymphocytes.

      Nos résultats sont différents de ceux obtenus avec les Eimeria du poulet. En effet, les travaux réalisés sur la détermination du phénotype des cellules transporteuses d'E. acervulina ont montré que les sporozoïtes sont présents essentiellement dans les lymphocytes T-CD8+, parfois T-CD4+ mais jamais dans les lymphocytes B (Trout et Lillehoi, 1993 et 1995). Vervelde et al. (1995) ont également montré que parmi les lymphocytes hébergeant des sporozoïtes d'E. tenella 50% sont des lymphocytes T-CD8+ et très peu des lymphocytes B. La différence avec nos résultats dans la distribution des sporozoïtes entre ces 2 populations lymphocytaires est peut-être due à une différence dans le ratio B/T des tissus étudiés. En effet, chez le lapin, la lamina propria est très riche en lymphocytes B particulièrement dans le GALT (observation personnelle, Ermak et al., 1994). Nous ne pouvons cependant pas déterminer si les parasites pénètrent préférentiellement dans l'une des 2 populations, B ou T, puisque les excrétions obtenues avec les 2 types cellulaires sont proches.

      Par ailleurs, les observations de Vervelde et al. (1995) ont montré que seulement 12% des sporozoïtes d'E. tenella sont observés dans des leucocytes de l'épithélium et de la lamina propria. En revanche, dans le cas des Eimeria du lapin, et plus particulièrement pour E. coecicola, les sporozoïtes présents dans la lamina propria sont presque toujours observés dans des cellules de type lymphoïde (Pakandl et al., 1993 et 1996b ; Renaux et al., 2001). Dans notre étude nous avons également montré que la majorité des sporozoïtes devait être présente dans les lymphocytes B et T. En effet, bien que d'autres cellules (cellules non marquées dont la nature n'est pas précisément définie) soient parfois capables d'induire une infection chez les receveurs, l'excrétion obtenue est 100 à 1000 fois moins importante qu'avec les lymphocytes marqués. De plus, comparativement au duodénum, la grande majorité des cellules de l'appendice vermiforme est constituée de leucocytes (environ 90%) ; ainsi, la probabilité que les sporozoïtes soient hébergés par un autre type cellulaire, non leucocytaire, est très limitée.

      L'hypothèse formulée par Pakandl et al. (1995) était que les sporozoïtes étaient transportés par les lymphocytes intra-épithéliaux (LIE) du duodénum jusqu'à l'appendice vermiforme. Dans l'intestin des mammifères, et particulièrement dans l'appendice du lapin, la plupart des LIE sont des cellules T, et majoritairement des lymphocytes CD8+ (Ermak et al., 1990). Dans nos expériences, les parasites sont retrouvés à la fois dans les lymphocytes B et les lymphocytes T. Ainsi, les sporozoïtes pourraient gagner, via les LIE, la lamina propria du duodénum et pourraient alors pénétrer dans d'autres lymphocytes. Les parasites atteindraient ainsi l'appendice vermiforme transportés par les LPL plutôt que par les IEL.

      Le transport du parasite par les cellules lymphoïdes pose le problème de la dualité fonctionnelle de ces cellules au cours de l'infection parasitaire. En effet, ce sont ces mêmes lymphocytes (et plus particulièrement les lymphocytes T-CD8+) qui sont les cellules effectrices de l'immunité anti-parasitaire (Trout et Lillehoj, 1995).


Cycle parasitaire abortif des sporozoïtes après inoculation intraduodénale et parentérale à des animaux préalablement infectés

      Afin de déterminer à quel moment l'immunité intervient dans le cycle de développement du parasite, nous avons inoculé des sporocystes par voie intraduodénale à des animaux immuns et observé la migration des parasites dans les différents organes. La pénétration et la migration des sporozoïtes sont plus ou moins inhibées en fonction du degré d'immunogénicité de l'espèce parasitaire et du degré d'immunisation des animaux. Ainsi, avec E. intestinalis la pénétration des parasites dans la muqueuse duodénale est inhibée dès la 2ème inoculation alors qu'avec E. coecicola l'inhibition de la pénétration n'apparaît qu'à la 3ème ou 4ème inoculation. De même, l'inhibition de la migration du parasite varie selon le degré d'immunisation des animaux. Avec E. coecicola, les sporozoïtes atteignent la muqueuse intestinale de l'organe cible mais restent dans la lamina propria et ne se divisent pas.

      D'autres travaux réalisés essentiellement chez le poulet ont montré que les mécanismes immunitaires mis en jeu peuvent varier en fonction de l'espèce parasitaire. En effet, l'acquisition de l'immunité conduit à une diminution de la pénétration des sporozoïtes dans la muqueuse cæcale dans le cas d'une infection à E. tenella, mais à une augmentation de la pénétration des parasites dans la muqueuse duodénale avec E. acervulina (Augustine et Danforth, 1986). Les parasites qui pénètrent ont la possibilité de migrer vers les cryptes des villosités mais restent bloqués dans les lymphocytes intra-épithéliaux, dans la lamina propria, et ne poursuivent pas leur développement (Horton-Smith et al., 1963 ; Rose et al., 1984b ; Riley et Fernando, 1988). Ces résultats sont en accord avec nos observations chez le lapin.

      Chez le poulet, Riley et Fernando (1988) ont également montré que l'infection par E. maxima pouvait être transférée à des animaux sensibles par ingestion de broyats de foie ou de rate d'animaux immuns réinfectés. Ainsi, l'acquisition de l'immunité n'empêche pas la dissémination du parasite dans l'organisme de l'hôte.

      Par ailleurs, l'injection IV de sporozoïtes à des lapins immunisés ne permet pas l'aboutissement du cycle parasitaire. Ainsi, les mécanismes immunitaires locaux mis en jeu dans la lumière intestinale ne sont pas les seuls à intervenir pour arrêter le développement des parasites. D'autres travaux ont abouti aux mêmes résultats avec E. tenella (Long et Rose, 1965). Les immunoglobulines sériques présentes chez les animaux immunisés pourraient contribuer à la protection puisque leur transfert à des animaux sensibles, avant ou dans les heures suivant l'injection IV des sporozoïtes, inhibe au moins partiellement le développement des parasites.


Etude de la reponse immunitaire de l'hôte

      L'immunité du lapin vis-à-vis d'E. intestinalis est très forte. Ainsi, alors que cette espèce possède le taux de multiplication le plus élevé chez le lapin, et qu'un inoculum au-delà de 2500 oocystes peut-être mortel lors d'une infection primaire, l'excrétion d'oocystes n'est quasiment plus détectable dès la deuxième inoculation. A la troisième inoculation, des doses 20 fois supérieures à la dose mortelle ne permettent plus d'obtenir d'excrétion. Nous avons donc cherché à caractériser les mécanismes immunitaires protecteurs et dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux populations lymphocytaires sollicitées au cours de l'infection et à la cinétique de mise en place de l'immunité spécifique.


Développement de la réponse immune mucosale

      Le développement d'E. intestinalis se déroulant dans les entérocytes de l'iléon, la réponse immune mucosale, par l'intermédiaire des LIE et des LPL, doit constituer la première ligne de défense de l'hôte contre le parasite. Des études immunohistologiques et de microscopie électronique réalisées chez l'animal immun ont en effet pu montrer que si le parasite pénètre dans la muqueuse intestinale son développement semble bloqué à ce niveau (M. Pakandl, communication personnelle).


Implication des sous-populations lymphocytaires CD4+ et CD8+

      Un suivi des sous-populations lymphocytaires CD4+ et CD8+ de l'intestin par cytométrie en flux, nous a permis de constater que, chez les lapins primo-infectés, les 2 populations de lymphocytes, CD4+ et CD8+ augmentaient à la fin de la période patente (14 jours p.i.). Chez le poulet, après une infection primaire par E. tenella ou E. acervulina, une telle augmentation des LIE et LPL CD4+ et CD8+ se produit à la fin de la période prépatente (Lillehoj, 1994 ; Bessay et al., 1996 ; Vervelde et al., 1996). Dans le cas d'une infection par E. maxima, une augmentation biphasique correspondant à la fin de la période prépatente puis de la période patente est également observée ; cette augmentation intéresse à la fois les LPL CD4+ et les LPL et LIE CD8+ (Rothwell et al., 1995). Ainsi, chez le lapin comme chez le poulet, les changements concernant les 2 sous-populations lymphocytaires CD4+ et CD8+, au cours de la primo-infection, semblent être corrélés avec 2 phases majeures du cycle parasitaire : l'arrêt des mérogonies (qui correspond également au déclenchement de la gamogonie et au début de la différenciation des oocystes)et la fin de la production d'oocystes.

      Chez les lapins immuns, protégés par des infections répétées, l'inoculation de fortes doses d'oocystes conduit à une augmentation de la proportion des lymphocytes CD8+. Cette augmentation, plus précoce que lors de l'infection primaire, est observée dès le 3ème jour p.i. et, 14 jours p.i., les lymphocytes CD8+ intestinaux représentent 30% des lymphocytes totaux contre 10% chez les animaux non infectés, ce qui suggère un rôle de ces cellules dans la protection. En revanche, aucune variation dans la proportion des lymphocytes CD4+ au cours des réinfections successives n'est observée. De même chez le poulet, lors de l'infection secondaire par E. maxima ou E. tenella, les LIE CD8+ sont rapidement mobilisés et présents en plus grand nombre que les lymphocytes CD4+ dans la muqueuse intestinale (Rothwell et al., 1995 ; Jeurissen et al., 1996 ; Vervelde et al., 1996). Dans le cas d'E. acervulina, la réinfection induit une augmentation à la fois des lymphocytes CD4+ et CD8+ dans la lignée de poulets sensible (Lillehoj, 1994), mais uniquement des lymphocytes CD8+ dans la lignée de poulets résistante ; cette augmentation, qui concerne plus particulièrement les lymphocytes CD8+ TCRab persiste jusqu'à 17 jours après l'inoculation (Lillehoj et Bacon, 1991). Cependant, les variations dans les proportions de lymphocytes CD8+ observées chez le poulet sont souvent de faible amplitude par rapport à nos observations réalisées chez le lapin. En revanche, des résultats comparables aux nôtres ont été obtenus chez la souris dans le cas d'infection par E. papillata : la proportion des lymphocytes CD8+ augmente après l'infection primaire (passant de 10 % chez les animaux témoins à 20-30 % chez les animaux infectés) et reste élevée au cours des inoculations successives (Schito et al., 1998).

      L'examen immunohistologique de coupes d'intestin nous a permis de constater que les lymphocytes CD8+ infiltrent la lamina propria 14 jours après la primo-infection et sont présents en grand nombre dans l'épithélium 21 jours p.i.. Chez les animaux immunisés, l'inoculation d'épreuve n'a pas induit de recrutement supplémentaire de ces lymphocytes ; cependant, lors de la réinfection chez le poulet, le recrutement des lymphocytes est parfois très rapide et transitoire. La fréquence de nos observations a peut-être été insuffisante pour détecter le phénomène.

      Par ailleurs, les variations dans les sous-populations lymphocytaires CD4+ et CD8+, ainsi que les infiltrations de la lamina propria par les lymphocytes CD8+, ont été identiques dans le duodénum et dans l'iléon des lapins infectés. Ces observations démontrent que la muqueuse de l'intestin grêle réagit comme un tout. Nos résultats sont en contradiction avec ceux de Bessay et al. (1996) qui, dans les cas d'infections par E. tenella ou E. acervulina, observent une réponse immune cellulaire limitée au site de développement du parasite. Cependant, avec ces mêmes espèces, Girard et al. (1997) ont démontré la sécrétion d'anticorps spécifiques tout le long de l'intestin. Dans notre étude, la présence de cellules immunes sur toute la longueur de l'intestin pourrait expliquer que peu de sporozoïtes pénètrent dans le duodénum des lapins immuns par rapport aux lapins primo-infectés (Drouet-Viard et al., 1994b), et que le nombre de parasites atteignant l'iléon soit extrêmement faible (observations personnelles).

      Dans les ganglions mésentériques, nous avons observé une augmentation transitoire des lymphocytes CD8+, concomitante de l'infiltration de la muqueuse intestinale au cours de l'infection primaire. En comparaison, chez les souris infectées par E. papillata, les variations affectant les lymphocytes T sont plus importantes mais la cinétique est identique à celle observée dans la muqueuse intestinale du lapin : les lymphocytes CD4+ augmentent transitoirement et la proportion de lymphocytes CD8+ augmente et reste élevée après la fin de la période patente (Schito et al., 1998).

      Chez les lapins primo-infectés, la prolifération spécifique des lymphocytes en présence d'antigènes parasitaires est détectée à partir de 7 jours p.i. et devient significative 14 jours p.i.. Ainsi, le début de l'expression de la réponse immune locale semble corrélé à la fin des mérogonies. La même cinétique a été observée chez des souris de lignée résistante primo-infectées avec E. vermiformis (Rose et al., 1990) : la réponse proliférative débute 8 jours après l'inoculation et les cellules du ganglion mésentérique sont alors capables de transférer l'immunité. Dans une lignée de souris plus sensibles, la réponse proliférative spécifique et la capacité des cellules à transférer une immunité protectrice sont retardées (Rose et al., 1990) ; de même, dans le cas d'infection par E. vermiformis, des mérogonies supplémentaires, une persistance du parasite dans les entérocytes et une plus large distribution du parasite dans l'épithélium intestinal peuvent être observés (Rose et Millard, 1985 ; Rose et al., 1985). En revanche, avec E. pragensis ou E. papillata, il n'y a pas de prolongation de la période patente chez des souris plus permissives (Rose et Hesketh, 1986 ; Schito et al., 1996). Ainsi, seules certaines espèces d'Eimeria semblent posséder un cycle de développement intrinsèquement limité. Pour E. intestinalis, lorsque le nombre d'oocystes inoculés augmente l'excrétion parasitaire atteint un plateau et ne dépasse pas 109 oocystes excrétés par lapin. Des études supplémentaires sont nécessaires pour expliquer cette particularité des Eimeria du lapin et pour déterminer si la mise en place de l'immunité cellulaire spécifique 7 jours p.i. peut limiter la multiplication du parasite ou si le nombre de mérogonies est génétiquement fixé.


Origine et rôle des lymphocytes impliqués

      Au cours de la primo-infection nous avons constaté un important recrutement des lymphocytes CD8+ dans la lamina propria 14 jours p.i.. Dans l'intestin, les LIE et les LPL sont composés de lymphocytes possédant des phénotypes différents : les LIE sont très majoritairement T CD8+ et les LPL majoritairement T CD4+ et B. Ainsi, l'infiltration de la lamina propria par les lymphocytes CD8+ correspondrait davantage à un recrutement de LIE que de LPL. Cette hypothèse est renforcée par nos observations à 21 jours p.i. où les lymphocytes CD8+ sont présents en grand nombre dans l'épithélium. Chez les mammifères, et plus particulièrement chez la souris, il existe 2 populations de LIE CD8+ qui possèdent des origines différentes : les lymphocytes CD8+aa thymoindépendants et les lymphocytes CD8+ab thymodépendants. Les LIE thymoindépendants proviennent de la moelle osseuse et migrent directement dans l'épithélium intestinal dans lequel ils se différencient (Guy-Grand et al., 1978 ; Mosley et al., 1990 ; Bandeira et al., 1991 ; Guy-Grand et al., 1992). Chez la souris, la prolifération des LIE CD8+aa a lieu au sein de structures particulières de la lamina propria appelées cryptopatches (Saito et al., 1998). Les LIE thymodépendants proviennent du thymus et migrent notamment dans les plaques de Peyer où ils se différencient sous l'influence des antigènes du contenu luminal internalisés dans la muqueuse par les cellules M. Ils poursuivent ensuite leur maturation et leur prolifération dans le ganglion mésentérique drainant, avant de rejoindre la lamina propria. Au cours de la primo-infection par E. intestinalis, l'importante hyperplasie ganglionnaire observée 14 jours p.i. et l'augmentation transitoire de la population CD8+ sont en faveur d'un recrutement des lymphocytes thymodépendants. En effet, la stimulation de ces cellules dans les plaques de Peyer, leur migration et leur prolifération dans les ganglions mésentériques pourraient expliquer l'hyperplasie ganglionnaire, et leur recirculation vers la lamina propria, l'aspect transitoire de leur augmentation dans les ganglions mésentériques.

      La troisième inoculation des lapins avec 50000 oocystes provoque une nouvelle augmentation de la proportion des lymphocytes CD8+ dans l'intestin. Cette augmentation est plus précoce que lors de l'infection primaire et est visible dès 3 j.pi.. Chez la souris, la recirculation des lymphocytes des plaques de Peyer jusqu'à la lamina propria requiert 4 à 6 jours (Hall, 1979). Ainsi, chez les lapins immuns, le recrutement et/ou la prolifération précoce des lymphocytes pourrait se dérouler davantage in situ. Cependant, la gangliomégalie est encore importante (observations personnelles) et les inoculations rapprochées, tous les 15 jours, n'excluent pas une recirculation possible des lymphocytes due à l'inoculation précédente. En revanche, après l'inoculation d'épreuve des animaux immuns avec 1000 oocystes, on n'observe pas d'augmentation de la proportion de lymphocytes CD8+, ni de nouvelle infiltration de la lamina propria. Or, chez la souris, des LIE CD8+ab, appartenant à la population impliquée dans la protection contre T. gondii, peuvent présenter un phénotype de cellule mémoire (Lepage et al., 1998). Il est donc possible que lors de l'infection réalisée avec des doses massives d'oocystes d'E. intestinalis, la mise en place de cellules mémoire permette le contrôle de l'infection subséquente et l'élimination des parasites.

      Notre étude de la cinétique d'évolution des sous-populations lymphocytaires CD4+ et CD8+ ne permet pas de déterminer leur importance relative dans l'acquisition de l'immunité. Cependant, les 2 types, CD4+ et CD8+, semblent impliqués au cours de l'infection primaire alors que seule la population CD8+ est sollicitée au cours des réinfections successives. Dans d'autres modèles, les lymphocytes CD4+ jouent un rôle essentiel dans le contrôle de l'infection primaire, notamment par leur production d'IFN-g qui orienterait la réaction immunitaire vers un profil de type Th1 et une réponse à médiation cellulaire (Wakelin et al., 1993 ; Harp et al., 1994 ; Gazzinelli et al., 1996b ; Yun et al., 2000). Les LIE CD8+, qui semblent davantage impliqués dans le contrôle de la réinfection (Rose et al., 1992 ; Trout et Lillehoj, 1996), peuvent agir sur les cellules infectées par différents mécanismes de cytotoxicité (perforine, FaS-Ligand, granzyme, granulysine) (Lepage et al., 1998 ; Schito et al., 1998). Ces lymphocytes peuvent également intervenir dans la régulation de la réponse en induisant la production de cytokines inflammatoires comme l'IFN-g, ou de cytokines anti-inflammatoires comme le TGF-b (Kasper et Buzoni-Gatel, 2001).


Réponse immune systémique : détection de l'activation de ses effecteurs

      Pour évaluer la réponse immune systémique nous avons étudié la variation cinétique des proportions des lymphocytes spléniques CD4+ et CD8+, testé leur prolifération spécifique et dosé les IgG sériques. Contrairement à ce qui est observé dans les ganglions mésentériques, aucune variation significative dans le nombre de cellules spléniques et dans les proportions des sous-populations de lymphocytes T n'a pu être mise en évidence au cours des inoculations successives. Chez le poulet primo-infecté par les Eimeria, les descriptions concernant l'évolution cinétique des populations de lymphocytes T systémiques sont contrastées. Bessay et al. (1996) ont démontré avec E. acervulina et E. tenella que le nombre de lymphocytes CD8+ diminue durant les 4 jours précédant la fin de la période prépatente surtout dans le sang, alors que Breed et al. (1996) ont démontré, également avec E. tenella, une augmentation des lymphocytes T CD8+ à la fin de cette période prépatente (8 jours p.i.). Dans le premier cas, les auteurs suggèrent que la baisse du nombre de lymphocytes T CD8+ systémiques est due à leur migration vers l'intestin. Dans le second cas, les auteurs supposent que cette augmentation des lymphocytes CD8+ du sang est un préalable à leur migration vers la rate et les sites spécifiques de l'infection dans l'intestin. Cependant, dans ces 2 études les variations dans les proportions de lymphocytes T systémiques sont transitoires. Ainsi, l'absence de variation observée chez le lapin au cours de la primo-infection pourrait être due à des observations trop distantes (0, 3, 7, 14 jours p.i.).

      Contrairement à ce qui a été observé, chez les lapins immuns, et chez le poulet et la souris dès la primo-infection (Rose et al., 1988b ; Martin et al., 1993 et 1995), aucune réponse proliférative spécifique n'est obtenue avec les cellules de la rate chez les lapins primo-infectés, et ce jusqu'à 21 jours p.i.. Durant cette période la prolifération non spécifique, induite par la Concanavaline A, reste inchangée. L'absence de réponse proliférative n'est donc pas due à une incapacité des cellules à proliférer ni à une immunosuppression transitoire provoquée par l'infection comme cela a été montré dans les cas d'infections par E. tenella ou par T. gondii (Rose et Hesketh, 1984a ; Candolfi et al., 1994). Dans notre étude, l'absence de réponse est peut-être due à un manque de sensibilité du test lié à la plus faible proportion de lymphocytes T présents dans la rate des lapins (40%) comparée notamment au poulet (60%). Vingt-huit jours p.i. une réponse proliférative spécifique est malgré tout observée avec les splénocytes de deux animaux sur trois. Dans ce cas, une recontamination de l'animal ne peut être exclue et la restimulation de l'immunité cellulaire au cours de la réinfection pourrait expliquer la réponse des cellules spléniques.

      Par ailleurs, nous avons dosé les IgG sériques spécifiques ; elles apparaissent entre le 7ème et le 14ème jour après l'inoculation et restent au même niveau jusqu'à 21 jours. Cependant, les titres en anticorps mesurés 14 jours p.i. sont 40 fois moins importants que ceux des animaux immuns. La cinétique correspond à celle observée avec E. tenella mais les titres que nous obtenons sont inférieurs (Mockett et Rose, 1986) et nous n'observons pas d'amplification significative de la réponse anticorps entre le 14ème et le 21ème jours p.i. contrairement au cas du au rat infecté avec E. nieschulzi (Rose et al., 1984c). Ainsi, au cours de l'infection primaire la réponse systémique reste faible.

      Jusqu'à ce jour, nous n'avons pu mettre en évidence de phase extra-intestinale pour E. intestinalis comme nous l'avons montré pour E. coecicola (Renaux et al., 2001), espèce qui induit une splénomégalie importante. Nous pouvons supposer qu'avec E. intestinalis trop peu d'antigènes parasitaires circulent dans l'organisme de l'hôte au cours de la primo-infection pour induire une réponse systémique forte.

      En conclusion, l'immunité contre E. intestinalis cause d'importants changements dans les populations mucosales de lymphocytes T. Ces changements affectent principalement la sous-population CD8+ qui infiltre le ganglion mésentérique et la lamina propria de l'ensemble de l'intestin grêle et dont la proportion reste élevée longtemps après la fin de la période patente. Bien qu'une forte réponse systémique puisse être observée après plusieurs inoculations, l'immunité locale impliquant principalement les lymphocytes CD8+ doit jouer un rôle essentiel dans la limitation de la primo-infection et dans la résistance locale à la réinfection.


Conclusion et perspectives

      L'hypothèse formulée au début de cette étude était celle d'un transport extra-intestinal des sporozoïtes par les lymphocytes, du duodénum jusqu'à leur site de développement.

      Le travail réalisé avec E. coecicola a apporté des arguments en faveur de cette hypothèse. Les injections de sporozoïtes par voie systémique ont montré qu'au moins certains atteignent l'intestin et achèvent leur cycle de développement. Les études d'immunohistochimie ont permis de démontrer la présence extra-intestinale du parasite au cours de la phase invasive. La reproduction de l'infection chez des animaux naïfs, par injection intraveineuse de préparations d'organes (rate et ganglions mésentériques) issus d'animaux infectés, a permis de démontrer que les parasites présents dans ces organes étaient infectants. Les injections de parasites par voie extra-intestinale notamment les inoculations intra-utérines, ont démontré que la voie luminale n'est pas indispensable à la réalisation du cycle parasitaire. De plus, il existe un véritable tropisme du parasite pour son site de développement intestinal spécifique car l'inoculation d'un même nombre de parasites par voie intra-utérine ou par voie intraduodénale conduit à des excrétions d'oocystes comparables. Tous ces arguments, la présence de parasites infectants dans les organes extra-intestinaux, leur tropisme pour le site de développement, sont en faveur d'une véritable migration extra-intestinale. Les expériences de radiomarquage des parasites n'ont pas jusqu'à maintenant permis d'élucider le trajet migratoire. Des essais de marquage à l'indium111 des sporozoïtes d'E. coecicola, espèce plus résistante qu'E. intestinalis avec laquelle avaient été réalisés les premiers essais, sont envisagés. De plus, des sondes spécifiques des différentes Eimeria du lapin, en cours d'obtention au laboratoire, devraient permettre de réaliser des infections expérimentales avec des doses beaucoup plus faibles de parasites et de détecter leur présence dans les organes après amplification par PCR. Ainsi, l'animal ne serait plus dans des conditions d'hyperparasitisme.

      La présence des parasites infectants a été démontrée aussi bien dans les lymphocytes B que dans les lymphocytes T, à la fois dans le duodénum, et à leur arrivée dans l'appendice vermiforme. Cette constatation, associée à la présence de parasites infectants dans les ganglions mésentériques au cours de la phase invasive, est en faveur du transport des parasites du duodénum jusqu'à l'appendice vermiforme, par les lymphocytes qui recirculent dans l'organisme par la voie lymphatique puis sanguine. Ce mode de transport des sporozoïtes expliquerait les résultats obtenus après injection intra-utérine de sporozoïtes. En effet, la muqueuse utérine est riche en vaisseaux lymphatiques et sanguins et il semble qu'il existe un lien fonctionnel entre le tissu lymphoïde associé au tractus génital d'une part et le tissu lymphoïde de l'appendice et de l'intestin distal d'autre part. La présence dans la muqueuse utérine de lymphocytes possédant des récepteurs d'écotaxie permettant leur recrutement dans l'appendice, et le transport des parasites par ces lymphocytes, expliquerait l'efficacité inattendue de cette voie d'inoculation. L'étude des récepteurs d'écotaxie exprimés à la surface des cellules parasitées dans les organes extra-intestinaux pourrait nous renseigner sur le devenir de ces cellules et sur leur éventuelle recirculation vers l'intestin. Une question reste ouverte : le parasite peut-il agir sur le lymphocyte hôte et entraîner sa recirculation dans l'organisme jusqu'à son site de développement ?

      L'acquisition de l'immunité dans le cas de l'infection par E. intestinalis est liée au développement d'une importante réaction immune mucosale au cours de l'infection primaire. Cette réponse est caractérisée par de profonds changements dans les proportions des sous-populations lymphocytaires T, affectant plus particulièrement les lymphocytes CD8+ qui infiltrent la lamina propria de tout l'intestin grêle et les ganglions mésentériques. Dans l'intestin, la proportion de ces cellules reste élevée longtemps après la fin de la période patente. Ainsi, les lymphocytes CD8+ pourraient jouer un rôle central dans la résistance locale lors de la réinfection. La réponse immune systémique (production d'IgG, prolifération des lymphocytes spléniques) reste limitée au cours de la primo-infection et n'est détectable qu'après plusieurs inoculations. La réaction mucosale pourrait jouer un rôle dans la limitation du nombre de mérogonies dès la primo-infection et un rôle prépondérant lors de la réinfection.

      Le rôle respectif des lymphocytes CD4+ et CD8+ dans l'acquisition de l'immunité pourrait être approfondi. En effet, le développement récent d'outils immunologiques chez le lapin, comme le clonage des gènes des cytokines (annexe 2), devrait permettre de doser par RT-PCR la production des cytokines décrites comme jouant un rôle dans l'infection par les Eimeria et de déterminer la localisation des cellules productrices de ces cytokines par hybridation in situ.

      La démonstration, comme chez le poulet, de la dualité fonctionnelle des lymphocytes qui interviennent dans le transport des parasites au cours de l'infection primaire et dans la réponse immune protectrice au cours des infections suivantes ouvre de nombreuses perspectives à notre travail. Il serait dans un premier temps intéressant de déterminer si les lymphocytes CD8+ dans le cas d'infections par E. coecicola sont impliqués à la fois dans la réponse immune et dans le transport du parasite. Il s'agirait ensuite de déterminer dans quel type cellulaire sont bloqués les sporozoïtes chez les animaux immuns et de mesurer l'activité cytotoxique des lymphocytes CD8+ contre des cellules infectées in vitro.


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