DISCUSSION DISCUSSION
Les résultats obtenus au cours de ce travail de thèse ayant déjà été discutés dans les articles issus de ces études, nous essaierons plutôt dans la présente discussion, d’élargir notre sujet en tentant de répondre à des questions plus générales que celles pouvant être développées dans une publication scientifique. Nous organiserons cette discussion en trois grandes parties :
Analyse
des mécanismes de la résistance
1.
Le mécanisme décrit chez T. circumcincta est-il le seul impliqué
dans la résistance aux BZs chez cet organisme ?
Avant de mettre en œuvre différents mécanismes intervenant directement sur le toxique, un virus, une bactérie, un insecte ou un nématode peuvent essayer d'éviter d'entrer en contact avec ce dernier. Ces mécanismes à l'origine d'un changement du comportement de l'organisme doivent être considérés comme étant l'une des premières étapes de l'acquisition de la résistance. Mais ils ne permettent pas d'obtenir un bon niveau de résistance et seront donc rapidement remplacés par d'autres processus beaucoup plus efficaces. De plus, ce type de mécanisme est difficile à envisager dans le cas des résistances aux herbicides chez les plantes, et dans le cas des organismes parasites où les refuges possibles dans le but d'éviter le composé toxique, sont restreints. Il ne faut cependant pas les négliger, car grâce à eux tous les individus d'une population ne mourront pas lors du traitement et ces individus seront peut être à l'origine du développement futur d'un autre mécanisme plus efficace. Les principaux cas de résistances observées par modification du comportement ont été réalisés chez les insectes. Parmi les insectes phytophages, plusieurs espèces évitent naturellement certaines plantes en raison des composés toxiques produits par ces dernières, l'importance de ces mécanismes étant beaucoup plus limité dans le cas de produits toxiques de synthèse (Brattsten et al., 1986). Le changement de comportement peut résulter de l'immobilité des formes larvaires de l'insecte en présence du composé toxique, ce qui permet une imprégnation beaucoup plus faible de ces dernières, la faible quantité de toxique ingérée pouvant dans ce cas facilement être dégradée par les systèmes de détoxication de la larve. Inversement, on s'aperçoit que les adultes sont hyperactifs en présence du toxique et s'envolent rapidement à la recherche d'un gîte plus sain où le toxique n'est pas présent. Ces deux exemples de comportement particuliers des larves et des adultes permettant d'améliorer le niveau de résistance aux toxiques furent décrit chez Heliothis virescens (Tobacco Budworm) par Sparks et al. (1989). Enfin, l'influence d'un toxique sur le comportement peut s'observer dans le choix et le moment de la ponte d'une femelle chez plusieurs espèces d'insectes (Brattsten et al., 1986). L'une des illustrations du changement de comportement d'un organisme peut résider dans une réduction de l'absorption du composé toxique, mais cette action semble aussi très limitée et ne permet pas d'obtenir un bon niveau de résistance, surtout lorsque le composé toxique peut pénétrer directement par les téguments du corps de l'organisme. L'adaptation du comportement d'un organisme dans les mécanismes de résistance aboutit le plus souvent à une impasse dans l'évolution de cette dernière, car sans accès aux composés toxiques l'insecte survivra, mais succombera dès qu'il entre en contact avec le toxique sans avoir pu se reproduire (Brattsten et al., 1986). Concernant les trichostrongles parasites de ruminants, de tels mécanismes peuvent-ils expliquer la survie des parasites aux traitements anthelminthiques ? La taille de leur habitat chez l'hôte étant de part sa nature assez réduite, les possibilités d'évitement du toxique par les formes parasitaires semblent limitées dans l'espace. En revanche le mécanisme d'hypobiose, qui se traduit par un retard de développement (proche d'une diapause) des larves L4 dans la muqueuse du tube digestif pourrait être un moyen d'échapper aux traitements. Le très faible niveau du métabolisme de ces larves et leur position dans la muqueuse les placent en partie à l'abri de l'action des anthelminthiques. Le but principal du phénomène d'hypobiose est de retarder de façon transitoire, l'évolution des larves durant les périodes hivernales dans le but de soustraire les larves qui auraient été produites par les adultes aux mauvaises conditions du milieu extérieur. Différents facteurs vont déclencher la reprise d'activité des larves inhibées dans leur développement (Cabaret, 1977). Ce processus permet donc d'augmenter la survie des strongles. Ce phénomène montre que certains mécanismes comportementaux peuvent être sélectionnés chez ces parasites pour répondre aux conditions particulières de leur environnement. Pour poursuivre sur ces mécanismes d’évitement, un arrêt transitoire de la ponte chez les femelles est souvent observé à la suite des traitements par les anthelminthiques. Ce mécanisme peut avoir uniquement un déterminisme physiologique et provenir de l’action du composé sur la capacité de ponte des femelles, mais il peut aussi être en rapport avec un comportement particulier sélectionné en réponse aux traitements. Par ce moyen, la femelle en arrêtant l'émission des œufs éviterait que ces derniers n'entrent en contact avec les résidus d'anthelminthiques pouvant être contenus dans les matières fécales. Cette hypothèse mériterait cependant d’être vérifiée. Ces mécanismes de modification du comportement ne sont que des processus palliatifs permettant de limiter l'impact des toxiques (empêcher que toute la population ne soit décimée) avant la sélection d'un mécanisme plus efficace dans la population. Ils sont assez limités chez les strongles digestifs.
La seconde étape du développement de la résistance à un toxique est souvent d’utiliser des mécanismes initialement présents chez l'organisme, permettant la détoxication (dégradation) du composé et son élimination hors de la cellule ou sa séquestration (qui consiste au transfert de la substance au niveau d'un compartiment cellulaire où il sera inoffensif). Ces mécanismes peuvent être interdépendants et ils confèrent plutôt une tolérance au composé qu’une véritable résistance. Les exemples les plus documentés se rapportent à la tolérance de certaines espèces d'insectes phytophages aux composés toxiques (alcaloïdes, terpènes ou phénols) produits par certaines plantes (Brattsten et al., 1986). De même, il existe de nombreux mécanismes d'efflux de la drogue décrit chez plusieurs espèces de bactéries et ceci pour différents toxiques (Levy, 1992). Certains de ces mécanismes sont endogènes et permettent l'élimination du toxique sans changement préalable de sa structure. La plupart de ces mécanismes d'efflux sont actifs et nécessitent premièrement une source d'énergie, deuxièmement la présence de vésicules excrétrices ou de protéines "carrier" au sein du cytoplasme de la cellule (afin de permettre le transport de la drogue vers le milieu extérieur) et enfin troisièmement une protéine au niveau de la membrane cellulaire à l'origine d'un canal indispensable pour l'expulsion finale du composé. Cependant, le niveau d'activité de ces mécanismes est souvent assez médiocre et il n'induit qu'un faible niveau de résistance (ou de tolérance) au composé toxique dans la souche bactérienne. Chez Escherichia coli, il existe plusieurs mécanismes endogènes qui permettent le transport hors de la cellule des composés toxiques comme les quinolones (Cohen et al., 1988). Mais ce processus est rapidement saturé et ne contribue que pour une faible part dans la résistance à ces composés. De même chez Staphylococcus aureus, il existe un système identique d'efflux des toxiques hors de la cellule mais son degré d'activité semble lui aussi très faible (Kaatz et al., 1991). Ces mécanismes permettent donc un accroissement transitoire de la tolérance avant l'apparition d'un second mécanisme beaucoup plus efficace. Existe-t-il de tels mécanismes chez les strongles digestifs et quelles sont leurs influences sur la résistance (ou la tolérance) aux BZs ? Suite à son absorption, le composé toxique peut être excrété sous sa forme initiale ou être dégradé par des enzymes en différents composés secondaires plus ou moins toxiques. La métabolisation des toxiques se réalise selon deux phases qui seront l'hydrolyse par oxydation ou réduction du composé, puis la conjugaison des produits obtenus avec d'autres composés comme certains acides aminés, différents sucres et le glutathion.
- Concernant la première phase, chez les insectes et les vertébrés le cytochrome P450 permet l'oxydation de nombreux composés endogènes et exogènes. Pour l'instant, chez les nématodes et chez les cestodes, la mise en évidence d'une enzyme similaire a été un échec (Kawalek et al., 1984). Mais ce résultat peut s'expliquer par le fait que les tentatives de détection furent réalisées avec des sondes dérivant de P450 d'insectes ou avec des anticorps reconnaissant cette enzyme chez les poissons ; une homologie insuffisante de séquence peut donc être le principal biais (Barret, 1997). Il faut d’ailleurs noter que chez C. elegans deux gènes dont les séquences codantes montrent beaucoup de similarités avec celles des cytochromes P450 connues, ont été découvertes (Waterston, 1992). L'activité de cette enzyme chez les helminthes semble toutefois être assez faible. Ceci peut s'expliquer par la nature anaérobie de l'habitat des helminthes parasites (les cytochromes- oxydases étant réoxydées par l'oxygène moléculaire) et selon une théorie qui envisage une adaptation des helminthes parasites aux conditions de vie chez leur hôte les conduisant "à faire confiance" aux réactions de détoxication de ces derniers pour l'élimination des composés toxiques. Enfin, ces réactions d'oxydation par la P450 pouvant produire des radicaux libres intermédiaires et d'autres composés annexes à l'origine de dommages importants des tissus, il a été aussi proposé que l’absence de ces mécanismes pouvait constituer finalement un avantage adaptatif (Precious et Barrett, 1989a). Il existe donc de nombreuses hypothèses essayant d'expliquer cette absence de cytochrome P450 chez les helminthes parasites mais aucune d'elles n'est vraiment satisfaisante. La seule certitude concernant ce sujet est que si ces protéines existent, elles ont un niveau d'activité très faible chez les helminthes parasites. La réalisation de cette première phase de dégradation des toxiques chez les helminthes doit donc s’appuyer sur d'autres mécanismes de réduction ou d'hydrolyse puisque les réactions d'oxydation ne semblent jouer qu’un rôle mineur. Un certain nombre d'hydrolases ou d'enzymes catalysant différentes réactions de réduction (Precious et Barrett, 1989b) et permettant la dégradation des composés toxiques ont d’ailleurs été signalées chez les helminthes parasites.
- Concernant la seconde phase du métabolisme des toxiques impliquant la conjugaison des composés secondairement formés ou des formes initiales du composé (si sa structure le permet), il semble là-encore que ces réactions sont aussi très limitées chez les helminthes par rapport à celles observées chez les mammifères. La principale réaction décrite est une conjugaison des produits avec le glutathion, ce processus étant catalysé par la glutathion transférase (Barrett, 1995). Le niveau d'activité le plus important pour cette enzyme fut mis en évidence chez les cestodes et les digènes alors que le niveau d'activité de cette enzyme semble très modéré chez les nématodes. En revanche l'activité de la glutathion transférase semble plus importante chez les nématodes parasites du tractus digestif en comparaison de celle observée pour les nématodes localisés dans les tissus ou le sang. Il a aussi été décrit une augmentation du niveau d'activité de la glutathion-S-transférase dans une souche résistante aux BZs chez H. contortus par rapport à une souche sensible (Kawalek, 1984). Mais cette observation demeure anecdotique et ne semble pas se reproduire chez d'autres souches de ce nématode provenant d'endroits géographiques différents.
La troisième étape de la métabolisation des toxiques est leur excrétion ou leur séquestration. Les processus d'élimination nécessitent la présence sur la membrane des cellules d'une pompe permettant un efflux actif des composés hors de la cellule. Jusqu'à présent, une seule structure de ce type fut décrite chez les helminthes mais elle ne permet l'expulsion que de composés conjugués à la glutathion transférase (Barrett, 1997). Chez des bactéries résistantes aux antibiotiques, ces processus d'efflux de la drogue nécessitent le plus souvent un système de navette permettant de faire migrer le composé toxique jusqu'à la membrane de la cellule (Levy, 1992). Ce système peut être réalisé par différents éléments cités précédemment (protéines "carrier" ou vésicules excrétrices) qui pourront se mouvoir dans la cellule grâce aux réseaux de microtubules. Les BZs déstabilisant le réseau de microtubules, il semble évident que même si de tels mécanismes d'excrétion existaient au sein des cellules des nématodes parasites, leur fonction serait altérée par l'action de l'anthelminthique. En revanche, il est possible que dans les souches de strongles digestifs résistantes aux BZs et présentant la mutation au niveau du gène de la b-tubuline les mécanismes d'excrétion des composés toxiques soient effectifs et permettent d'augmenter le niveau de résistance. Les mécanismes permettant la séquestration du produit nécessitent l'intervention de certaines protéines fixant les structures lipidiques. Les helminthes parasites possèdent ce type de protéine (Janssen et Barrett, 1995) mais elles ne permettent pas la fixation des BZs et des ivermectines. En conclusion, les mécanismes endogènes de détoxication chez les helminthes parasites ne semble présenter qu'une capacité très limitée à métaboliser un composé toxique, notamment par l'absence d'enzymes efficaces (Barrett, 1997). L'influence de ces mécanismes de détoxication dans le développement de la résistance aux anthelminthiques chez les helminthes parasites et en particulier concernant celle aux BZs chez T. circumcincta est donc peu probable.
La troisième étape du développement de la résistance à un toxique est liée à des processus mutationnels. Ces événements sont très complexes et peuvent avoir une influence sur la cible de la drogue, sur les enzymes intervenant dans les processus de détoxication ou sur celles permettant les transports intracellulaires.
- La simple substitution d'un acide aminé de la séquence d'un gène, provenant de la mutation ponctuelle d'un nucléotide peut permettre de diminuer l'affinité du composé pour son récepteur ou le degré de stabilité du complexe formé entre ces deux éléments, d'augmenter la capacité catalytique des enzymes de détoxication ou des protéines permettant le transport de la drogue hors de la cellule.
- L'amplification d'un gène existant peut permettre de compenser la fonction des récepteurs sur lesquels se fixe la drogue ou d'accentuer l'efficacité des mécanismes de détoxication ou de transport des toxiques, selon que l'amplification intéresse le gène codant pour le récepteur de la drogue ou ceux codant pour différentes enzymes. Ce type de mécanismes semble notamment expliquer le développement de la résistance aux organosphophorés chez Culex p quinquefasciatus (Mouchès et al., 1986). Les forts niveaux de résistance à ces composés chez cet insecte s'expliquent par l'amplification du nombre de copies du gène de l'estérase B1 qui est une enzyme intervenant dans les processus de détoxication. Un second exemple montre que la résistance à la pyriméthamine chez Plasmodium falciparum est associée à une duplication du gène codant pour la cible du toxique (le gène de la Dihydrofolate Reductase ou DHFR), les mécanismes de résistance impliquant une baisse de la perméabilité des membranes n'étant pas assez efficaces chez ces protozoaires (Inselburg et al., 1987).
- L'inactivation d'un gène existant par diminution de sa transcription ou son élimination définitive par délétion peuvent être d'autres mécanismes à l'origine du développement de la résistance, mais ils n'interviennent généralement que si le toxique augmente la fonction de son site de fixation, augmentation à l'origine de désordres importants au sein des cellules ou si l'enzyme de détoxication permet la production de composés secondaires encore plus toxiques que la drogue initiale. Jusqu'à présent le seul exemple de diminution de la transcription du site d'action d'un composé toxique fut observé chez les insectes en conditions uniquement de laboratoire (Hall et Kasbekar, 1989) lors de résistance aux pyrétroïdes.
Ces processus mutationnels qui permettent le plus souvent d'obtenir un bon niveau de résistance chez un organisme peuvent se conjuguer avec les mécanismes décrits précédemment. Chez les bactéries par exemple, la résistance aux b-lactames (pénicillines) peut être obtenue par hydrolyse de la drogue, modification du récepteur à ses composés au niveau des membranes cellulaires ou expulsion active de ces composés hors de la cellule (Baquero et Blásquez, 1997). Mais les particularités physiques et biochimiques du toxique (structure, son mode d'action, sa localisation chez l'organisme traité) et les répercussions sur la fonction principale du gène lors des événements mutationnels peuvent avoir une influence sur la sélection préférentielle d'un mécanisme par rapport aux autres. Il semble cependant que les processus mutationnels au niveau de la cible du composé constituent le mécanisme le plus fréquemment rencontré lors du développement de la résistance. Les mécanismes d'amplification de la cible du toxique sont beaucoup plus rares (principalement en raison des fortes répercussions d'un tel mécanisme sur la valeur sélective). Ces mécanismes d'amplification pourront plus facilement être sélectionnés dans le cas de résistance impliquant l'utilisation d'une enzyme de détoxication (Taylor et Feyereisen, 1996). La résistance par délétion ou sous-expression d'un gène semble être un mécanisme très peu fréquent ; ceci s’explique probablement par le fait que ce type de mécanisme à un coût élevé sur la fitness en induisant la perte ou la moins bonne réalisation de la fonction normale du gène impliqué.
Jusqu’à présent, nous avons largement orienté notre discussion par rapport aux effets de la mutation de l’acide aminé 200 de l’isotype 1 de la b-tubuline. Il est nécessaire maintenant d'entrevoir les possibilités que d'autres processus mutationnels puissent permettre une résistance aux BZs chez T. circumcincta.
L'acquisition de la résistance aux BZs semble principalement liée au changement d'une Phénylalanine par une Tyrosine en position 200 de l’isotype 1 du gène de la b-tubuline aussi bien chez T. circumcincta que chez Haemonchus contortus ou Trichostrongylus colubriformis (Kwa et al., 1994). Mais chez H. contortus, il semblerait qu’aux niveaux élevés de résistance, un deuxième mécanisme intervient. Il correspond à la délétion du second isotype du gène de la b-tubuline. D'autres travaux (Beech et al., 1994) n'ont cependant pas permis d'obtenir la confirmation de cette délétion chez des populations très résistantes. Chez un autre nématode Caenorhabditis elegans il a été montré que la résistance aux BZs semble liée à la délétion du locus ben-1, un gène de sensibilité. Mais on remarque aussi qu'une Phénylalanine en position 200 caractérise le gène de la b-tubuline subissant la délétion partielle ou totale, alors qu'il y a une Tyrosine à ce même site sur les gènes de b-tubuline ne subissant pas de délétion. Il semble donc actuellement difficile d’estimer l’importance relative des deux mécanismes décrits chez les nématodes (mutation et/ou délétion). Nos résultats montrent une bonne adéquation entre la mutation décrite sur l’isotype 1 et le niveau de résistance estimé par DL50 dans des populations naturelles. Mais aucune des populations que nous avons étudiées ne présentaient véritablement un niveau de résistance très élevé. Chez les levures et les champignons, d'autres mutations que celle observée à l’acide aminé 200 sont associées à la résistance aux BZs. Certaines d'entre elles ne permettent pas une résistance aux fortes concentrations d'anthelminthique, notamment chez Physarum (Burland et al., 1984). D’autres (Tyr/Asn ou Ser en 50, Gln/Lys en 134 et Met/Leu en 257) obtenues par mutagenèse dans certaines souches d'Aspergillus nidulans sont thermosensibles (Koenraadt et al., 1992) et induisent une diminution importante de la valeur sélective des mutants les portant. Enfin chez les levures, deux mutations associées à la résistance aux BZs sont observées en position 198 (Glu/ Asp ou Gln ou Lys ou Gly) et en position 200 (Phe/Tyr) mais seule cette dernière permet d'obtenir un très bon niveau de résistance (Orbach et al., 1986). Il est donc possible que l’analyse d’un plus grand nombre de populations de T. circumcincta ou d’un plus grand nombre d’individus au sein même de ces populations puisse révéler l’existence d’autres mutations associées à la résistance aux BZs sur le gène de la b-tubuline. Cependant, le fait d’avoir observer jusqu’à présent la mutation à l’acide aminé 200 dans toutes les populations résistantes aux BZs de T. circumcincta et dans des organismes aussi différents que les champignons et les nématodes suggère qu’il existe un bon équilibre entre le gain qu’elle apporte lorsque des BZs sont utilisés et le coût qu’elle génère en modifiant la structure tridimensionnelle de la protéine.
La mutation en position 200 semble être à l'origine du mécanisme majeur d'acquisition de la résistance aux BZs chez les nématodes trichostrongles, il faut donc s'interroger sur son rôle fonctionnel dans la résistance.
2.
Comment cette mutation peut-elle fonctionnellement conférer une résistance
aux BZs chez T. circumcincta ?
Les conséquences fonctionnelles d’une mutation ponctuelle peuvent être diverses. Parmi les nombreux exemples disponibles, nous en citerons quelques-uns pour lesquels la mutation induit des modifications au niveau d’enzymes intervenant dans la détoxication ou dans les processus de métabolisation des drogues. Ces mutations ponctuelles peuvent aussi avoir pour conséquence de diminuer l’affinité de la drogue pour sa cible par simple modification de la nature de son récepteur. L'ACV (acyclovir) est un agent antiviral fréquemment utilisé lors des traitements consécutifs à une infection par le virus de l'herpès (Palù et al., 1992). La plupart des recherches réalisées sur des souches de laboratoire ou naturelles résistantes à ce composé révèlent un manque d'expression de la thymidine kinase (TK) virale (De Clercq, 1985). Chez ces virus, la résistance est associée à la délétion d'une seule base sur ce gène qui est à l'origine d'un décalage de la phase ouverte de lecture et de la création de novo d'un codon stop. Par ce changement la protéine obtenue est tronquée mais jusqu’à présent, il est difficile de comprendre fonctionnellement comment cette protéine plus courte est associée à la résistance à ce composé. De nombreux exemples ont été décrits chez les bactéries. A la suite d’une mutation non-sens entraînant la substitution d'une seule base, un codon stop est créé au niveau du gène Kat G (codant pour une catalase à l'origine de l'activation d’une prodrogue, l'isoniazide) d’isolats de Mycobacterium tuberculosis résistants à l'isoniazide (Heym et al., 1995). Cette mutation se traduit par une perte de l’activité catalytique de l’enzyme ce qui va empêcher l'activation de la pro-drogue et engendrer une résistance à ce composé chez cet organisme. Chez cette bactérie résistante à de nombreuses molécules, d'autres mutations ont été décrites. Concernant les toxiques agissant sur la synthèse protéique comme la streptomycine, une seule mutation provoquant le changement d'un acide aminé au niveau d'une des protéines des ribosomes permet la résistance. Ces mutations ponctuelles se situent sur l'une des parties les plus conservées de ces protéines et altèrent le niveau de fixation de la drogue sur son récepteur (Douglass et Steyn, 1993). Concernant les toxiques agissant sur la synthèse des acides nucléiques, comme la rifampicine qui est un dérivé semi-synthétique, la résistance est aussi liée à l'unique changement d'un acide aminé au niveau du site présumé de fixation de la drogue, un gène codant pour une RNA polymérase (Honore et Cole, 1993). En revanche, pour les fluoroquinolones (des dérivés de l'acide nalidixique qui est un composé naturel) qui ont une action sur la gyrase, il semble que la résistance provienne d'une accumulation de mutations sur ce gène (Revel et al., 1994). Cette résistance semble combinée à d'autres processus qui augmentent la perméabilité membranaire afin de permettre l'expulsion du toxique hors de la cellule (Sullivan et al., 1995). Enfin, concernant les toxiques agissant sur la synthèse des membranes cellulaires (cell wall) comme l'ethambutol, on observe un mécanisme de résistance comparable aux fluoroquinolones, pour lequel l'accumulation de mutations sur le gène cible est à l'origine de la résistance (Sareen et Khuller, 1990). Chez les insectes, nous nous intéresserons à la résistance aux pyréthroïdes chez Drosophila melanogaster (Amichot et al., 1992). La cible de cet insecticide est une protéine formant un canal permettant les transports d'ions sodium. Parmi les deux gènes distincts codant pour ces structures, seul celui localisé sur le chromosome 2 est impliqué dans le développement de la résistance aux pyréthroïdes. Suite à des comparaisons de séquences de ce gène entre individus sensibles et résistants, il fut montré qu'une seule mutation non silencieuse permettait de différencier ces deux séquences. Ce changement est une transition d'une guanine en une adénine, provoquant la substitution d'un acide aspartique présent chez les individus sensibles par une Asparagine chez les résistants. L'absence d'interactions du toxique sur la protéine dérivant du second locus de ce gène sur le chromosome X s'explique par la présence naturelle, que les souches soient sensibles ou résistantes, d'une Asparagine à cette position. L'acquisition de la résistance aux pyréthroïdes chez cet insecte se réalise par cet unique changement qui provoque une diminution de l'affinité de la drogue pour son récepteur en modifiant le site de fixation de la drogue. Enfin chez les plantes, la résistance à l'atrazine chez Poa annua est due au changement d'un seul nucléotide au niveau d'un gène des chloroplastes qui code pour la protéine D1 du système photosynthétique II (Barros et Dyer, 1988). Ce changement qui provoque la substitution d'un acide aminé par un autre est à l'origine d'une baisse d'affinité de l'atrazine pour son site d'action chez les plantes résistantes, la protéine D1. Ce même changement associé à la résistance à l’atrazine fut décrit chez d'autres plantes (Amaranthus, Solanum nigrum, Senecio vulgaris) mais aussi chez une algue terrestre Chlamydomonas reinhardii.
Dans ces exemples, l'acquisition de la résistance par mutation ponctuelle se traduit soit par une perte d’activité enzymatique soit par une modification du récepteur de la drogue. Qu’en est-il pour la mutation faux-sens observée sur le gène de la b-tubuline chez T. circumcincta ?
- Une diminution de l'affinité entre les BZs et la b-tubuline peut être envisagée pour expliquer le rôle fonctionnel de cette mutation dans la résistance aux BZs mais ceci semble partiellement inexact car la constante d'association (Ka) entre ces deux éléments ne change pas lors de comparaison de cette valeur entre une souche sensible et une souche résistante de T. colubriformis et d'H. contortus (Lubega et Prichard, 1990; Russel et Lacey, 1992).
- Cette mutation peut aussi provoquer une plus grande instabilité du complexe formé entre la drogue et sa cible. Russel et Lacey (1992) ont montré que les interactions entre la tubuline et les BZs sont pseudo-irréversibles dans des souches sensibles d'Haemonchus contortus alors que la fixation des BZs sur la tubuline de souches résistantes à ce composé est réversible. Mais comment expliquer que cette simple mutation induit une plus grande instabilité du complexe formé entre les BZs et la tubuline chez les nématodes résistants ?
Cette mutation en position 200 du gène semble selon la température à laquelle on effectue l'étude, avoir une importance sur la conformation du site de la b-tubuline sur lequel se fixent les BZs. Russel et Lacey (1992) ont en effet montré que les interactions des Bzs avec la tubuline de nématodes sensibles ou résistants à ces composés dépendent de la température. La fixation des BZs chez une souche sensible de T. colubriformis se réalise principalement à 37°C, alors que chez une souche résistance de cette même espèce, le niveau maximum de fixation de ces composés s'obtient à 4°C. Or il est remarquable de noter que le même résultat est observé avec la tubuline de Vertébrés qui comporte comme chez les nématodes résistants aux BZs, une Tyrosine en position 200 du peptide. Ainsi la présence sur la b-tubuline, d'une Tyrosine à cette position chez les nématodes résistants (mais aussi chez les mammifères) doit sans doute se traduire selon la température par un changement de conformation de la protéine. Les BZs semblent pouvoir se fixer sur ce site dont la conformation est modifiée mais ils se décrochent très rapidement. A l'inverse, la présence d'une Phénylalanine sur la b-tubuline chez les nématodes sensibles aux BZs permet d'obtenir une conformation particulière du site de fixation de ces composés à 37°C, conformation qui permet la formation d'un complexe stable entre la drogue et sa cible. Dernièrement, il a été montré que la résistance à un herbicide (le dinitroaniline) chez la graminée Eleusine indica provenait du changement ponctuel d'une Thréonine par une Isoleucine en position 239 du gène de a-tubuline (Anthony et al., 1998). Cet acide aminé est proche du site d'interaction entre les dimères de tubuline au sein du protofilament des microtubules. La conclusion des auteurs de cette étude fut d'envisager que cette simple substitution d'un acide aminé, permettait d'augmenter la stabilité des interactions entre les dimères de tubuline au niveau de la forme polymérisée des microtubules. Cette portion particulière de la tubuline est très conservée entre les deux sous-unités d’a-tubuline et de b-tubuline Il serait certainement intéressant d'étudier si l'augmentation de la résistance chez les nématodes parasites par la substitution d'une Phenylalanine par une Tyrosine ne résulte pas comme dans cet exemple, d'une augmentation de la stabilité des interactions entre les dimères de tubuline.
Parmi tous les mécanismes de résistance invoqués, nous avons donc observé que la résistance aux BZs chez T. circumcincta semble principalement liée à une mutation qui provoque une diminution de l’affinité de la drogue pour sa protéine cible, la b-tubuline. Nous allons ensuite nous interroger sur les facteurs pouvant favoriser la sélection d’un tel mécanisme de résistance.
3.
Quels sont les facteurs favorisant la sélection d’un tel mécanisme
de résistance ?
Le nombre de sites d'action du composé toxique semble être un facteur très important pour expliquer l’acquisition de résistance par mutation ponctuelle. Des produits comme les pyréthroïdes, l'atrazine, la rifampicine et les BZs ont une action sur un seul type de récepteur qui est une protéine "fondamentale" très conservée. Dans ce cas, il semble évident que le changement de la structure tridimensionnelle de la cible par une simple substitution peut conférer une résistance à un toxique. En revanche, si le composé toxique interagit sur un groupe de protéines, l'acquisition de la résistance par une simple mutation ponctuelle est peu probable, car cette mutation devrait se produire conjointement sur des gènes dispersés dans le génome. C’est le cas pour certains antibiotiques comme le chloramphénicol, dont l'action se situe au niveau des ribosomes et où il n'a jamais été détecté de résistance à ces composés par le simple changement d'un acide aminé. Le développement de la résistance s'opère soit par l'acquisition d'un gène de résistance, qui aura pour action de détruire l'antibiotique avant sa fixation, soit par une augmentation des processus d'efflux du toxique (Spratt, 1994). Le deuxième élément nécessaire à l'acquisition d’une résistance par mutation ponctuelle est lié au fait qu’il doit exister un "équilibre" entre les changements conformationnels provoqués par la mutation et la fonctionnalité de la protéine issue du gène mutant. Il est en effet probable que dans de nombreux cas, ces mutations sont délétères ou ont un coût trop important sur la fitness des individus qui les portent. Nous reviendrons plus largement sur cette remarque et sur ses implications dans une phase ultérieure de la discussion. Enfin le développement de la résistance par mutation ponctuelle va dépendre de l’origine du composé toxique utilisé (composé de synthèse ou substance dérivant d'un composé naturel). L'obtention d'une résistance aux antibiotiques par mutation ponctuelle et changement d'un seul acide aminé arrive plus fréquemment si le toxique est un composé de synthèse. Pour les antibiotiques dérivant d'un composé naturel, la résistance provient le plus souvent de l'acquisition de certains gènes qui inactivent ou augmentent l'efflux de l'antibiotique (Spratt, 1994). Ces gènes de résistance ont évolué avec les bactéries afin de les protéger face aux antibiotiques produits par d'autres bactéries ou provenant de la bactérie elle même (Davies, 1992). En revanche, aucune enzyme permettant une dégradation des antibiotiques de synthèse (quinolones, sulfonamides etc.) n’a encore été décrite. Ces observations sur les mécanismes de résistance chez les bactéries en fonction de l’origine du toxique (synthétique ou naturelle) sont intéressantes car elles peuvent être transposées aux anthelminthiques. Parmi les groupes d'anthelminthiques les plus utilisés, on remarque que seules les lactones macrocycliques ou ivermectines dérivent d'un composé naturel issu d'une souche mycélienne de Streptomyces avermitilis (obtenus lors des mécanismes de fermentation). En revanche, les BZs sont des composés de synthèses (aucune production de ces composés par un organisme n'ayant jusqu'à présent été démontré). Lorsque l'on étudie les mécanismes de résistance pour ces deux groupes de composés on s'aperçoit que concernant les lactones macrocycliques, les mécanismes de résistance semblent reposer sur un processus d'efflux des toxiques par intervention d'une P-glycoprotéine membranaire (codée par un gène proche des gènes mdr des mammifères) alors que pour les BZs, une mutation sur le gène codant pour le site d'action du toxique (b-tubuline) permet d'obtenir une résistance.
Aspects
populationnels de la résistance
Après nous être intéressé aux mécanismes de la résistance aux BZs chez T. circumcincta, nous nous interrogerons dans la suite de cette discussion, sur les aspects populationnels de la résistance à ces molécules à travers trois questions :
- La première se rapporte à la valeur adaptative des gènes de résistance. Nous nous demanderons si les individus portant la mutation ont une fitness comparable à celle des individus sauvages.
- La seconde s’intéresse à l’origine des gènes de résistance. Nous essaierons de déterminer si l’apparition de la résistance dans un élevage résulte de processus migratoires ou de la sélection d’individus mutants nouvellement apparus.
- La troisième qui n’a été que partiellement abordée lors de ce travail, tentera d’évaluer les conséquences de l’acquisition de la résistance sur la variabilité génétique des populations parasites.
La
mutation de la b-tubuline associée à la résistance aux
BZs a-t-elle un impact sur la valeur sélective (fitness) des individus
qui la portent en absence de ces produits ?
L’intérêt de cette question est fondamental dans la perspective d’une meilleure compréhension du développement de la résistance dans un élevage. En effet, il a été montré par exemple, que la fitness relative des hétérozygotes avait une grande importance au début de l’installation de la résistance (Roush et McKenzie, 1987). Le deuxième intérêt de ces travaux se rapporte aux moyens de lutte pouvant être envisagés si les individus résistants présentaient une moins bonne fitness que ceux sensibles. La réintroduction de strongles sensibles dans des élevages résistants a par exemple été utilisées (Van Wyk et Van Schalkwyk, 1990) pour tenter de restituer une sensibilité des nématodes aux BZs dans ces élevages. L'objectif était d'obtenir des populations sensibles de nématodes et par voie de conséquences controlables par les anthelminthiques. Mais une telle mesure ne serait véritablement efficace que dans le cas où la fitness des individus réintroduits (sensibles) serait meilleure que celle des résistants. Pour ces raisons principales, plusieurs études ont donc été développées sur ce sujet. Kelly et al. (1978) ont montré tout d’abord chez H. contortus, que les individus d'une souche résistante semblent présenter une meilleure fitness que ceux d’une souche sensible. En revanche, McLean et al. (1987) ont observé le résultat inverse chez T. colubriformis. Enfin nos travaux chez T. circumcincta et ceux de Maingi et al. (1990) chez H. contortus suggèrent qu'il n'existe pas de différences de fitness entre les individus sensibles ou résistants aux BZs. Ainsi, à travers ces 4 études, il apparaît que des résultats totalement contradictoires ont été obtenus sur la valeur sélective comparée d’individus résistants ou sensibles aux BZs. Nous en essaierons de comprendre les raisons dans la suite de cette discussion.
Le premier point important devant être évoqué se rapporte à la façon d’estimer la fitness. Dans les travaux réalisés par Kelly et al. (1978), seul un très faible nombre de traits de vie (le taux d'installation des larves infestantes chez le ruminant et le taux d'éclosion des œufs) est étudié ce qui ne permet pas d’obtenir une estimation satisfaisante de la fitness. Pour illustrer ces propos, il est possible de décrire brièvement un exemple emprunté aux études réalisées chez Plasmodium falciparum (Koella, 1998). Dans cette synthèse, Koella montre que la résistance aux chloroquines est associée à une augmentation de la transmission (par une augmentation de la production de gamétocytes et d’oocystes). Or, les études épidémiologiques semblent montrer que si les drogues ne sont plus utilisées, la résistance diminue dans les populations parasites. Pour expliquer ces résultats contradictoires, diverses hypothèses ont été proposées. Il apparaît par exemple, que l’augmentation de la charge parasitaire chez les moustiques (liée à la plus forte production de gamétocytes par les souches parasites résistantes) serait susceptible de provoquer une mortalité plus forte. Il est donc nécessaire d’envisager le cycle dans son ensemble car des phénomènes "compensatoires" sont susceptibles d’intervenir. Pour les Trichostrongles parasites, seuls nos travaux et ceux de Maingi et al. (1990) ont tenté de tenir compte de ce facteur. Pour s’affranchir de ces difficultés de mesure de la fitness, il semble que la meilleure approche possible consiste à comparer l’évolution des fréquences des trois génotypes (rr, rS, SS) sur plusieurs générations. C’est ce que nous avons réalisé en laboratoire sur 3 générations et ce que nous tentons de faire sur le terrain actuellement sur un nombre supérieur de générations.
Le deuxième élément qu’il est nécessaire de prendre en compte pour expliquer les résultats contradictoires obtenus, se rapporte aux conditions dans lesquelles sont effectuées les expériences pour comparer les fitness. Chez Drosophila melanogaster par exemple, Shabalina et al. (1997) ont montré qu’en absence de compétition, aucune différence dans la fitness des individus sauvages ou mutants ne pouvait être mise en évidence. En revanche, lorsque ces mêmes souches sont placées en situation de compétition, la fitness des individus mutants se révèle moins bonne que celle des individus sauvages. Seuls nos travaux ont pris en compte la compétition pour effectuer des études comparées de la fitness chez les trichostrongles. Par contre, les facteurs climatiques ont été ignorés dans toutes les études alors que l’on dispose d’exemples montrant leur importance. Chez Lucilia cuprina, la fitness relative des phénotypes sensibles et résistants fut de nombreuses fois estimée en conditions de laboratoire, en présence ou en l'absence de traitements par plusieurs insecticides comme la dieldrine, le lindane ou le diazinon (Whitten et al., 1980). Mais aucune de ces études ne prenaient en compte l'influence de la saison hivernale sur la survie des stades larvaires, notamment lors du passage des larves au stade de pupe puis au stade adulte (McKenzie, 1990). Sur le terrain, dans les populations d'insectes non soumises aux effets de l'hiver, la sélection contre les individus résistants est faible. En revanche, cette sélection contre les individus résistants devient sévère lorsque la période hivernale a un impact important sur les populations (McKenzie, 1990). C’est pour cette raison que nous avons entrepris notre étude sur le terrain dont les premiers résultats ont jusqu’à présent confirmé ceux obtenus en laboratoire, c'est-à-dire que les fitness entre les nématodes résistants et sensibles semblent très proches.
Le troisième élément que nous évoquerons pour expliquer les résultats contradictoires obtenus chez les trichostrongles, se rapporte au choix des souches effectué pour ces expérimentations. Concernant Kelly et al. (1978) par exemple, les deux souches d’H. contortus comparées (sensible et résistante) avaient des origines géographiques distinctes. De plus, l'une des souches (celle présentant le phénotype résistant) était maintenue au laboratoire depuis 19 générations ! Ainsi, la meilleure valeur sélective des individus de cette souche résistante pouvait reposer à la fois sur une histoire de vie différente de celle des individus de la souche sensible en liaison avec leurs origines distinctes, mais aussi sur une meilleure adaptation aux conditions de laboratoire de cette souche qui était ainsi maintenue depuis de nombreuses générations. Les mêmes remarques peuvent plus ou moins être faites pour les autres travaux. En ce qui concerne nos études, l'outil de typage nous a permis de différencier au sein d'une même population, les individus des trois génotypes (rr, rS, SS). Les comparaisons ne pouvaient donc être influencées par l'origine des souches.
Nos résultats nous paraissent donc être les plus fiables car ils résultent d’expérimentations dans lesquelles nous avons tenté de nous prévenir au maximum des biais qui accompagnent ce type de protocoles. Il convient d’attendre les résultats de l’approche réalisée en conditions naturelles pour confirmer la validité de nos affirmations. Les données épidémiologiques montrant une absence de réversion de la résistance aux BZs en l'absence de traitements, semblent cependant aller dans le même sens.
Si l’allèle mutant ne confère aucun désavantage sélectif, on peut se demander si ce phénomène résulte de la sélection du meilleur allèle adaptatif possible ou de la sélection de gènes "modifieurs" renforçant l’avantage sélectif conféré par l’allèle adaptatif. Dans la première hypothèse, il faudrait alors se demander pourquoi cet allèle qui confère un énorme avantage sélectif dans certaines conditions (traitements) et qui ne semble pas avoir de coût, n’est pas présent dans toutes populations parasites. Il est difficile de répondre à ces questions dans le cas de nos travaux.
- Concernant la première hypothèse, il faut noter que d’autres mutations sur le gène de la b-tubuline peuvent conférer une résistance aux BZs mais que la plus fréquente est celle affectant l’acide aminé 200. Pour certaines de ces mutations décrites chez les champignons, un coût a même été très clairement démontré (Thomas et al., 1985). Il ne faut donc pas exclure que d’autres mutations aient pu être associées à la résistance aux BZs mais que finalement celle de l’acide aminé 200 se soit progressivement imposée par son absence de coût. Chez les insectes, un tel phénomène semble actuellement se réaliser dans le sud de la France pour un allèle de résistance aux organophosphorés. En effet, chez Culex pipiens, l’allèle A1 est progressivement remplacé par un allèle A4-B4 qui semble présenter un moindre coût (Berticat, 1998). Ainsi, pour répondre à cette question chez les trichostrongles, il serait nécessaire d’étudier des populations parasites soumises aux traitements par les BZs depuis peu de temps afin de déterminer si d’autres mutations sont associées à la résistance à ces produits.
- La sélection de gènes "modifieurs" ne peut pas non plus être exclue dans le cas des trichostrongles parasites. Les travaux de Maingi et al. (1990) ont en effet montré que la fitness des individus d’une souche résistante d’H. contortus évoluait suivant le niveau de résistance. A partir de leurs résultats, ils proposent la séquence évolutive suivante :
1) Dans une population dite naïve (n'ayant subi aucun contact préalable avec la drogue) les individus sensibles sont avantagés et présentent une meilleure fitness par rapport au petit nombre d'individus résistants déjà présents.
2) Lorsque la drogue est introduite et que les parasites acquièrent progressivement de meilleurs niveaux de résistance les capacités d'adaptation du parasite sont altérées par la perte des caractères de sensibilité ou par la sélection d'autres caractères sur le génome des individus résistants ce qui se traduit par une moins bonne fitness des individus résistants par rapport aux sensibles.
3) Lors d'une troisième étape, la population de nématodes devient fortement résistante aux BZs et la fitness (établissement, survie et reproduction) des individus résistants redevient proche de celle des individus sensibles.
Cette évolution de la fitness résulterait donc de processus de co-adaptations (Roush et McKenzie, 1987). Un exemple de ces processus est proposé dans les travaux de McKenzie et Batterham (1994). Les résistances au diazinon et au malathion sont contrôlées chez L. cuprina par différents substitutions alléliques sur deux loci du chromosome IV, (Rop-1 pour la résistance au diazinon et Rma-1 pour celle au malathion). Dans ces 2 cas l'introduction de l'allèle de résistance dans le génome résulte d'une augmentation de l'asymétrie mesurable par un changement de phénotype (Bristle caractère), l'asymétrie des ailes chez les insectes étant un prédicteur de diminution de la fitness. Cet effet est dominant pour le diazinon et partiellement dominant pour le malathion. Au début de l'apparition de la résistance, la fitness relative des individus résistants est plus faible que celle des individus sensibles en absence du composé toxique. Si on poursuit l’utilisation du diazinon et que la résistance à ce composé devient plus importante, il y a sélection d'un gène "modifieur" qui améliore les effets de la résistance. La fitness des individus résistants et sensibles est alors comparable, même en absence de traitement par l'insecticide et seulement lors de la présence du gène "modifieur". Cet élément influence aussi la fitness des individus résistants au malathion, mais en revanche ce mécanisme est spécifique des résistances aux organophosphorés, car il n'y a aucune influence de ce gène "modifieur" dans le cas de résistance au dieldrin (McKenzie et Ofarrel, sous presse). Dans ces exemples le gène "modifieur" est un allèle du gène Scl (Scalloped wings) à l'origine du développement du système nerveux périphérique. On peut envisager la possibilité d'interactions entre les produits des gènes Rop-1 et Rma-1 avec ceux du gène Scl. Ces gènes non impliqués dans la résistance mais pouvant avoir une influence sur la fitness, seront sélectionnés conjointement aux gènes de résistance (McKenzie et Batterham, 1994).
Quelle
est l’origine des allèles mutants dans les populations résistantes
?
Cette question constitue le complément nécessaire à la précédente pour tenter de mieux comprendre l’installation de la résistance aux BZs dans les populations parasites de T. circumcincta. Trois hypothèses peuvent être proposées pour expliquer l’apparition des gènes de résistance. En premier lieu, il faut envisager la présence d’allèles rares dans les populations pouvant être sélectionnés grâce à la meilleure valeur adaptative qu’ils confèrent en présence d’un anthelminthique. En second lieu, il faut envisager l’existence de mutations spontanées pouvant être à l’origine d’un nouvel allèle résistant dans une population. Enfin, des processus migratoires peuvent assurer la dispersion des allèles de résistance d’une population à l’autre. Dans ce dernier cas, il semble possible de prévenir l’apparition de ce phénomène par un contrôle des organismes susceptibles d’introduire des parasites portant les gènes de résistance. En revanche, dans les deux premières hypothèses les pratiques d’élevage deviennent le facteur principal intervenant dans l’installation de la résistance.
L’étude de la bibliographie sur divers organismes montre que les processus migratoires semblent jouer un rôle fondamental dans l’apparition de la résistance dans une population. Ainsi chez les bactéries, il semble que les premières souches résistantes partagent en général le même gène nouveau de résistance (O’Brien, 1997) ce qui suggère une origine commune pour ce gène. De plus, chez ces organismes, les gènes de résistance peuvent être transmis d'une espèce à l'autre grâce aux plasmides qui sont des éléments d'ADN extrachromosomique capables de réplication indépendante. Ces plasmides sont transmis au cours des processus de conjugaison (mécanismes de transfert entre une bactérie mâle donatrice et une bactérie femelle réceptrice par formation d'un pont cytoplasmique entre les bactéries). Ainsi les souches d'Haemophilus ducryeyi résistantes aux pénicillines contiennent le plasmide portant le transposon tn3 qui code pour un seul gène de résistance et deux autres gènes permettant la transposition. Ce plasmide provient d'autres bactéries entériques (Brunton et al., 1986). Ces grandes possibilités de dispersion des gènes de résistance permettent de comprendre pourquoi il est possible d’observer le même gène de résistance dans des hôpitaux séparés de plusieurs milliers de kilomètres (O’Brien, 1997).
Chez les insectes, il est apparu que les processus migratoires jouent aussi un rôle important dans la dispersion des gènes de résistance. Chez Culex pipiens, la surproduction d'une estérase non-spécifique par amplification du gène codant pour cette protéine est le mécanisme le plus commun permettant à ces insectes de devenir résistant aux organosphosporés. Raymond et al. (1991) ont montré que la séquence nucléotidique du gène de l'estérase B2 de différentes souches d'insecte de cette espèce collectées dans des régions couvrant trois continents différents (Asie, Amérique du Nord et Afrique) était exactement la même. Ce résultat montre clairement que l'événement initial d'amplification du gène de l'estérase B2 (permettant la résistance) s'est produit à un seul endroit, puis qu'ensuite il y a eu dissémination de ce "gène de résistance" à travers le monde par migrations d'insectes résistants. Cette dispersion d'une localité à une autre peut se réaliser sur une longue distance par le transport de larves ou d'adultes, grâce aux transports aériens ou maritimes internationaux et sur une courte distance par le déplacement naturel d'insectes adultes.
Concernant les nématodes trichostrongles, nos résultats semblent plus difficiles à interpréter. Nous avons constaté tout d’abord que certaines populations partagent le même allèle portant la mutation impliquée dans la résistance, ce qui suggère l’existence de migrations assurant la dispersion de ces allèles. Cette dispersion pourrait être réalisée par des échanges entre les éleveurs, d'animaux infestés par des nématodes résistants. Or différentes enquêtes réalisées sur les pratiques d'élevages en région Centre (Cabaret et Gasnier, 1994), montrent que dans les élevages étudiés lors de nos travaux, les seuls échanges se rapportent à des chevrettes ou des boucs non parasités (n'ayant jamais connus le milieu extérieur) ce qui semble exclure cette possibilité. Des études développées dans notre laboratoire ont d’autre part montré que le lapin de Garenne et les lièvres n'hébergent pas T. circumcincta (Saulai et Cabaret, 1998) même en situation de cohabitation avec les petits ruminants, ce qui suggère que la dispersion des allèles de résistance par des animaux sauvages est aussi peu probable. Il est enfin difficile d’imaginer qu’un transport accidentel de larves de nématode par certains oiseaux puisse permettre la dispersion d’un nombre suffisamment important d’individus pour permettre l’installation d’un nouvel allèle dans une autre population de nématodes. Ces différents processus migratoires permettant une dispersion des allèles de résistance méritaient pourtant d’être examinés avec une grande attention puisqu’il existe des exemples où leur rôle a pu être fermement établi. Ainsi, la triple résistance aux BZs, ivermectines et levamisole observée chez certains éleveurs de Grande Bretagne provient d'échanges d'animaux avec des éleveurs de Nouvelle-Zélande chez qui cette triple résistance était depuis longtemps installée (Coles et al., 1998).
Si les migrations ne permettent pas d’expliquer le partage par certaines populations du même allèle résistant, la multiple présence de cet allèle ne peut alors provenir que d’une origine ancestrale commune. L’allèle mutant devait donc être présent dans la population parasite avant que s'organise la création des troupeaux. Le maintien de cet allèle rare s’expliquerait non seulement par son faible coût sur la fitness des individus le possédant, mais aussi par la taille importante des populations de nématodes parasites.
Nous avons d’autre part observé que certaines populations de nématodes présentent un allèle du gène de la b-tubuline portant la mutation conférant la résistance qui leur est propre. Ceci semble suggérer que des mutations spontanées peuvent survenir puis être sélectionnées dans ces populations. Là-encore, la grande taille des populations parasites pourrait favoriser ce type d’événement. Pour valider ces diverses hypothèses, il sera nécessaire d’effectuer un large effort d’échantillonnage dans différentes souches sensibles et résistantes aux BZs de ce nématode parasite afin de déterminer les séquences des allèles portant la mutation.
Quelles
sont les conséquences de l’acquisition de la résistance sur
la variabilité génétique des populations ?
Cette question n’a pas vraiment été abordée lors de notre travail de thèse mais certains résultats obtenus nous ont conduit à nous intéresser à ce problème. Une diminution de la variabilité de l’isotype 1 du gène de la b-tubuline a été observée dans les souches résistantes aux BZs aussi bien chez T. circumcincta que chez T. colubriformis (Grant et Mascord, 1996) et chez H. contortus (Kwa et al., 1993 ; Beech et al., 1994). Cette diminution était interprétée chez ces deux dernières espèces comme résultant de la sélection d’allèles résistants. Or, si l’on examine de plus près les résultats obtenus par Beech et al. (1994) par exemple, on s’aperçoit que les différences observées entre les souches sensibles et résistantes reposent uniquement sur des mutations silencieuses qui ne sont pourtant pas soumises à la sélection. Pour les trois espèces de trichostrongles étudiées, la seule mutation non silencieuse décrite jusqu’à présent est celle touchant l’acide aminé 200. La diminution du polymorphisme doit donc être interprétée différemment et deux hypothèses peuvent être proposées :
- Cette diminution peut traduire l’existence de goulots d’étranglement (bottlenecks) suivis de dérive génétique lorsque les premiers individus résistants sont sélectionnés dans les populations parasites après utilisation des BZs. Dans ce cas, une diminution du polymorphisme doit être observée à d’autre loci.
- Cette diminution peut refléter un effet d’auto-stop (hitchhiking) sur le gène de la b-tubuline lors de la sélection de la mutation avantageuse à l’acide aminé 200. Dans ce cas, aucune diminution du polymorphisme ne doit être observée à d’autres loci.
Kwa et al. (1993) avaient rejeté l’hypothèse d’une dérive génétique pour expliquer la diminution de la variabilité génétique du gène de la b-tubuline dans les populations résistantes car ils n’observaient pas ce même phénomène pour les gènes de l’a-tubuline et de l’actine. Cependant, cette étude reposait uniquement sur la comparaison du nombre d’allèles observés dans des pools d’individus issus de populations résistantes ou sensibles, et non pas sur des estimations du taux d’hétérozygotie par exemple. De tels travaux ont été en revanche réalisés dans notre laboratoire par Gasnier (1994) et plus récemment par Leignel dans le cadre de sa thèse (communication personnelle). Leurs résultats fondés sur l’analyse des isoenzymes et le séquençage d’un fragment de 500 pb d’un gène d’ADNm, ne révèlent aucune structuration génétique dans les populations qu’elles soient sensibles ou résistantes aux BZs. Ils semblent donc que l’acquisition de la résistance dans les populations parasites ne s’accompagne pas de goulots d’étranglement. Ainsi, la diminution du polymorphisme du gène de la b-tubuline semble résulter d’un effet d’auto-stop. Cette notion qui a été définie en premier lieu par Maynard Smith et Haigh (1974) puis confirmée par Kaplan et al. (1989), peut se définir de la façon suivante. Lorsqu’une mutation avantageuse apparaît dans une population, sa sélection entraîne avec elle celle de mutations neutres voisines. Ceci se traduit par une diminution de la variabilité autour de la mutation avantageuse, diminution qui sera d’autant plus forte que le taux de recombinaison dans cette région est faible. Un bel exemple d’effet d’auto-stop a été récemment mis en évidence chez Aedes aegypti (Yan et al., 1998) sur la région du chromosome 1 qui porte le locus de l’EST-4 associé à la résistance aux organophosphorés. La diminution du polymorphisme de l’isotype 1 du gène de la b-tubuline dans les populations parasites s’expliquerait donc par l’installation rapide de la mutation à l’acide aminé 200 lorsque les BZs sont utilisés. L’installation de la résistance aux BZs dans les populations de nématodes parasites de chèvres ne semble donc pas provoquer de profondes modifications au niveau de leur variabilité génétique. Ce résultat n’était pas attendu car comme nous l’avons évoqué précédemment, ces populations parasites sont isolées et subissent des effondrements démographiques très importants lorsque des anthelminthiques sont utilisés (réduction de la population de vers adultes chez les hôtes de plusieurs milliers à une valeur proche de zéro) ce qui pourrait conduire à de la dérive génétique. Cependant, ce résultat se comprend mieux si l’on tient compte de la taille importante des populations parasites et si l’on se souvient que les stades libres (qui ne sont pas touchés par les anthelminthiques) constituent un "réservoir" important de variabilité. Ainsi, lors de l’installation de la résistance dans une population parasite, les animaux traités se réinfestent avec des larves sensibles présentes sur le terrain. Les individus hétérozygotes pour la mutation de l’acide aminé 200 issus du croisement des individus homozygotes résistants sélectionnés par les BZs avec les individus sensibles issus des larves résiduelles présentes sur le terrain, vont avoir une descendance qui par le jeu des recombinaisons, pourra porter l’allèle résistant tout en conservant une variabilité génétique. La présence d’un nombre important de larves sur le terrain semble donc jouer le même rôle dans le maintien de la variabilité génétique que celui des zones refuges chez les insectes lorsque des traitements sont appliqués (Yan et al., 1998).