PRESENTATION DES ARTICLES
PREMIER ARTICLE : Sequences of b-tubulin cDNA
from benzimidazole-susceptible and DEUXIEME ARTICLE : A simple PCR method for rapidly detecting defined point mutation TROISIEME ARTICLE : PCR diagnosis of benzimidazole-susceptibility
or QUATRIEME ARTICLE : Polymorphism of the isotype
1 b-tubulin gene CINQUIEME ARTICLE : Fitness of benzimidazole-resistant
and
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Sequences of b-tubulin cDNA from benzimidazole-susceptible and -resistant strains
of Teladorsagia circumcincta, a nematode parasite of small ruminant (Séquences
des cDNA de la b-tubuline de souches sensibles ou résistantes aux benzimidazoles
chez Teladorsagia circumcincta, un nématode parasite de petits ruminants).
Loïc Elard, Ana M. Comes, Jean F. Humbert
Paru dans Molecular and Biochemical Parasitology 79 (1996) 249-253
L'objectif principal de cet article fut de comparer la séquence en cDNA du gène de la b-tubuline dans des souches de T. circumcincta, sensibles ou résistantes aux BZs. Le niveau de résistance ou de sensibilité, de chacune de ces souches provenant d’élevages caprins d'Indre et Loire, a été estimé in vitro par un test d'éclosion des œufs. La dose d'anthelminthique nécessaire à l'élimination de 50% de la population de nématodes (DL 50) était de 0.07 µg de Tbz/ml pour la souche sensible et de 1.05 µg de Tbz/ml pour celle résistante. Un protocole comprenant successivement l'extraction des ARNm de nématodes de la souche sensible aux BZs, leur transcription en cDNA suivie d'une amplification par PCR en utilisant un couple d'amorces choisies à partir de la séquence de l'isotype 1 du gène de la b-tubuline chez H.contortus, nous a permis dans un premier temps d'obtenir deux fragments chevauchants recouvrant 90% de la séquence de ce même gène chez T. circumcincta. En complément deux fragments correspondant aux extrémités 3' et 5' de ce gène ont été obtenus par RACE-PCR ce qui nous a permis de disposer de la séquence complète de l’isotype 1 du gène de la b-tubuline dans une souche sensibles aux BZs chez T. circumcincta. Cette séquence nucléotidique (Accession dans GenBank, Z69258), d'une longueur de 1347 paires de bases, présente une phase ouverte de lecture codant pour un polypeptide de 448 acides aminés. Cette séquence présente une forte ressemblance au niveau protéique (99%) avec la séquence de l'isotype 1 du gène de la b-tubuline d’H. contortus, et une ressemblance plus faible (94%) avec celle de l'isotype 2 de cette même espèce. Un séquençage a été ensuite entrepris sur le gène de la b-tubuline d’individus issus d’une souche résistante aux BZs afin de rechercher l’existence de mutations pouvant être associées aux mécanismes de résistance. La seule mutation non silencieuse mise en évidence correspond au changement d'une Phénylalanine par une Tyrosine en position 200 du gène de la b-tubuline comme cela avait été déjà observé chez d’autres nématodes et chez certaines espèces de levures. Pour pouvoir étudier la distribution de cette mutation dans les populations résistantes et rechercher sa présence éventuelle dans des populations sensibles autrement que par la technique de séquençage, il a été nécessaire de mettre au point un outil nous permettant de typer les individus par rapport à cette mutation. Cette méthode originale mise au point a fait l’objet de l’article suivant.
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A
simple PCR method for rapidly detecting defined point mutation (Une
méthode simple de PCR permettant de détecter rapidement une mutation
ponctuelle).
Paru dans Elsevier Trends Journals Technical Tips Online, 16/4/1997 (http://www.biomednet.com/db/tto)
La détection de la substitution d'une Phénylalanine (TTC) par une Tyrosine (TAC) en position 200 du gène de la b-tubuline est basée sur l’utilisation d’une PCR compétitive. Quatre amorces sont utilisées conjointement lors de la réalisation de cette amplification. Deux d'entre elles sont non spécifiques par rapport à la résistance ou à la sensibilité ; elles permettent l'amplification d'un fragment quel que soit le génotype du vers qui sert de témoin interne. Les deux autres amorces sont spécifiques soit de l'allèle sensible, soit de l'allèle résistant. En fait, seule la dernière base à leur extrémité 3’ (où s’initialise la réplication) est spécifique soit du A du codon TAC (Phe) soit du T du codon TTC (Tyr), comme cela est décrit dans le schéma présent à l'intérieur de la publication. La spécificité de l’amplification repose sur la compétition s’effectuant entre l’amplification du fragment non spécifique et l’amplification du fragment spécifique. Trois profils différents d'amplification peuvent être révélés selon le génotype du nématode après migration par électrophorèse et coloration par le bromure d'éthidium. Afin de valider cette méthode, la caractérisation de l’isotype 1 du gène de la b-tubuline au niveau de l’acide aminé 200, a été réalisée sur 20 individus, selon trois méthodes différentes : le séquençage direct d’un fragment où se trouve le site mutant, une autre méthode de PCR permettant de détecter une mutation ponctuelle et enfin selon notre technique. Chacune des trois méthodes a donné des résultats similaires.
Grâce a cet outil, nous avons pu ensuite poursuivre deux nouveaux objectifs qui consistaient à mettre en évidence la distribution de cette mutation dans différentes populations naturelles de T. circumcincta, provenant de diverses fermes et de rechercher s’il existait une corrélation entre la proportion d’individus mutants dans une population parasite et la DL50 estimée par les tests classiques. Les résultats de ces travaux ont fait l’objet de l’article suivant.
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PCR diagnosis of benzimidazole-susceptibility or -resistance in natural populations
of the small ruminant parasite, Teladorsagia circumcincta (Détection
par PCR de la sensibilité ou de la résistance aux benzimidazoles
de différentes populations du nématode parasite de petits ruminants,
Teladorsagia circumcincta).
Paru dans Veterinary Parasitology, Vol. 80 (3), jan. 1999, pp. 231-237 : abstract sur le site de la revue Veterinary Parasitology.
Le typage de nombreux individus issus de populations naturelles de T. circumcincta a montré tout d’abord qu'une forte proportion d'individus homozygotes sensibles non mutants (Phe/Phe) caractérisent les populations sensibles aux BZs tandis qu’une proportion variable d'individus homozygotes résistants (Tyr/Tyr) et d’individus hétérozygotes (Tyr/Phe) est observée dans les populations résistantes. Nous avons ensuite montré qu’il existe une corrélation positive entre l'estimation de la dose létale 50 par les tests classiques utilisés jusqu’à présent, et la proportion de nématodes homozygotes mutants (Tyr/Tyr). Ceci confirme l’importance de cette mutation dans la résistance aux BZs mais aussi la validité de cette nouvelle technique pour la détection de la résistance à ces composés. Enfin, nous avons observé dans certaines populations identifiées comme sensibles suite aux mesures de DL50, que des hétérozygotes mais aussi quelques homozygotes mutants sont présents. Cette découverte est très intéressante car elle montre que la résistance peut potentiellement être sélectionnée dans ces élevages mais que divers facteurs (sans doute liés aux pratiques d’élevage) permettent le maintien de la sensibilité aux BZs. Ce résultat montre aussi l’avantage de notre technique qui permet la détection des premiers individus mutants (homozygotes ou hétérozygotes) au sein d'une population de nématodes, ce qui était impossible jusqu'à présent avec les tests classiques de mesure de résistance.
L’importance de la mutation à l’acide aminé 200 de l’isotype 1 du gène de la b-tubuline semble donc assez clairement démontrée chez T. circumcincta. Des travaux chez H. contortus ont cependant montré que le polymorphisme du gène de la b-tubuline était plus faible dans les populations résistantes et que ce phénomène pouvait avoir un rôle majeur dans la résistance aux BZs. Nous avons donc tenté d'évaluer le rôle respectif de ces deux mécanismes dans le développement de la résistance aux BZs chez T. circumcincta, mécanismes qui ne nous apparaissent pas contradictoires à la différence de certains auteurs.
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Polymorphism
of the isotype 1 b-tubulin gene in benzimidazole-resistant or -susceptible populations
of the small ruminant parasite Teladorsagia circumcincta (Polymorphisme
de l'isotype 1 du gène de la b-tubuline chez différentes populations
sensibles ou résistantes aux benzimidazoles du nématode parasite
de petits ruminants Teladorsagia circumcincta).
Non publié. Texte intégral sur ce site.
Une première approche dans l’étude de la variabilité génétique de l'isotype 1 du gène de la b-tubuline a été effectuée dans plusieurs populations naturelles sensibles ou résistantes aux BZs par une technique de PCR-RFLP réalisée sur le gène entier. Ces travaux ont confirmé l’existence d’une diminution du polymorphisme du gène de la b-tubuline dans les populations résistantes. Un travail de séquençage portant sur un fragment de 550 paires de base situé dans la partie centrale du gène (contenant l’acide aminé 200) a ensuite été entrepris. Ce travail a confirmé la baisse du polymorphisme dans les populations résistantes mais a aussi révélé que les allèles impliqués dans la résistance n'étaient pas les mêmes dans toutes ces populations. Trois allèles différents portant la mutation à l’acide aminé 200 conférant la résistance aux BZs, ont en effet été observés. Un de ces allèles était présent dans plusieurs populations résistantes alors que les deux autres ne s’observaient que dans une seule population. Les séquences des allèles mutants semblaient suggérer pour l'une des populations, une origine assez récente de la mutation. Au cours de ce travail, nous avons aussi montré expérimentalement, que la diminution du polymorphisme dans les populations résistantes est liée à la perte des allèles non mutants au niveau du résidu 200. Enfin, il est apparu que la mutation conférant la résistance est récessive puisque seuls les individus homozygotes résistants (Tyr/Tyr) survivent à un traitement par les BZs.
Après avoir étudié les mécanismes permettant l’acquisition de la résistance, nous nous sommes ensuite intéressés à l'étude comparée de la fitness d’individus sensibles ou résistants aux BZs. De telles études avaient déjà été entreprises mais des résultats très contradictoires obtenus suggéraient qu'une poursuite de ces travaux étaient nécessaires.
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/ Fitness
of benzimidazole-resistant and susceptible worms of Teladorsagia circumcincta,
a nematode parasite of small ruminant (Fitness des vers sensibles ou
résistants aux benzimidazoles chez Teladorsagia circumcincta, un nématode
parasite de petits ruminants).
Paru dans Parasitology, Volume 117, Issue 6, Dec 1998, pp 571-578. Texte intégral sur ce site avec l'aimable autorisation de la revue.
Pour comparer la fitness d’individus résistants ou sensibles aux BZs, nous avons exploité l’outil permettant de caractériser les individus par rapport à la mutation de l’acide aminé 200 de l’isotype 1 du gène de la b-tubuline. Nos études ont en effet consisté à suivre l’évolution des proportions de chaque génotype (rr, rS et SS) au cours du cycle de ces parasites. A cette fin, nous avons développé deux approches. Dans la première, nous avons comparé les performances de chacun de ces génotypes au niveau des différents traits de vie que sont le taux d'installation des larves infestantes chez l'hôte, le taux de survie des adultes et des larves, la fertilité des femelles, le taux d’éclosion des œufs et le taux de développement des larves. Ces comparaisons ont été effectuées en plaçant les parasites dans différentes conditions de compétition. La seconde approche a été de comparer l'évolution de la fréquence de ces trois génotypes au cours de plusieurs générations en l'absence de traitements. Ces résultats n’ont pas permis de mettre en évidence de différences significatives dans la fitness des individus en fonction de leur génotype (rr, rS et SS). Il semble donc au vu de ces travaux qui sont poursuivis actuellement par une expérimentation sur le terrain, que la fitness des individus homozygotes mutants est comparable à celle des individus sensibles. Si cela se vérifie, il serait alors fort probable qu'aucune réversion de la résistance aux BZs ne se produise dans les élevages même lorsque les traitements sont arrêtés. Les données épidémiologiques disponibles semblent confirmer cette hypothèse.
