RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

   I. Les trichostrongles parasites de petits ruminants domestiques

Les nématodes parasites du tractus digestif, communément appelés strongles digestifs ou strongles gastro-intestinaux, font partie d'un ensemble comprenant au moins huit genres. Ils appartiennent à deux super-familles (Strongyloidea et Trichostrongyloidea) et se localisent dans différents organes du tractus digestif des ruminants domestiques. Certains sont inféodés à la caillette (Teladorsagia circumcincta et Haemonchus contortus), d'autres à l'intestin grêle (Trichostrongylus colubriformis) et d'autres encore au gros intestin (Oesophagostomum, Chabertia et Trichuris). Cette présentation des strongles parasites commencera par une description du cycle de développement de ces nématodes puis de l’espèce étudiée, Teladorsagia circumcincta.

   I.1. Cycle de développement des strongles digestifs

Ce cycle monoxène ou direct se divise en 2 phases, l'une parasite chez les ruminants, l'autre de vie libre dans le milieu extérieur au cours desquelles 5 stades de développement successifs sont observés (Maupas et Seurat, 1913) : - La phase de vie libre dans le milieu extérieur débute lorsque les œufs pondus par les femelles sont éliminés avec les fèces des ruminants et se retrouvent sur le pâturage. Leur développement sera assez rapide (10 jours) lorsque les conditions sont favorables. Les larves de premier stade évolueront après deux mues successives en larves de troisième stade (L3) infestantes pour l'hôte. Ces larves L3 qui peuvent résister plusieurs semaines dans le milieu extérieur, sont mobiles ce qui favorise leur ingestion par les ruminants présents sur le pâturage. - La phase de vie parasitaire chez l'hôte commence après l'ingestion des larves L3. Ces larves parviennent rapidement au niveau de la muqueuse du tube digestif pour y pénétrer. Elles subissent alors un dégainement qui est suivi d'une mue leur permettant d'atteindre le stade 4, évoluant lors d'une ultime mue en stade 5 (juvénile ou préadultes). L'acquisition de la maturité des juvéniles nécessite environ 5 jours. L'accouplement des adultes s’effectue au niveau de la lumière de l'organe cible, permettant aux femelles fécondées (ovipares) de libérer leurs œufs dans le milieu extérieur avec les fèces de l'hôte. Au cours des périodes favorables, la durée totale du cycle biologique des strongles digestifs est estimée à 1 mois. Les principaux facteurs intervenant sur cette durée sont la température et l'humidité qui ont une influence importante sur la vitesse du développement de l’œuf jusqu'à la larve L3 (Rossanigo, 1992). D'autre part la période prépatente de l'infestation, allant de l'ingestion des L3 au développement des adultes mâles et femelles qui est habituellement de 21 jours, peut être allongée en raison de variations produites par l'inhibition du développement des larves de stade 4 ou hypobiose des L4 (Reid et Armour, 1972). Ce phénomène, assez bien décrit chez les strongles digestifs (Cabaret, 1977), se produit dans les régions tempérées en hiver, pendant la période défavorable à la survie des vers dans le milieu extérieur. Enfin la durée d'évolution de la phase parasitaire varie en fonction de facteurs dépendant de l'hôte, comme sa race, son âge ou son état de santé.

   I.2. Présentation de l’espèce étudiée : Teladorsagia circumcincta

Teladorsagia circumcincta (Stadelmann, 1894) appartient à la famille des Trichostrongylidae et à la sous-famille des Ostertagiinae (Durette-Desset, 1989). Ce nématode se rencontre partout dans le monde à l'exception des zones tropicales. En France, il est présent dans la majorité des régions d'élevages ovins et caprins et infeste 80 à 100% des hôtes disponibles (Mangeon et Cabaret, 1987 ; Chartier et Reche, 1992). Sa localisation chez son hôte est la caillette dont il occupe aussi bien la partie pylorique que fundique (Cabaret, 1982).

  Morphologie

T. circumcincta est une espèce à sexes séparés présentant un dimorphisme sexuel prononcé entre mâle et femelle (Figure 1). Les mâles plus petits (9,14 mm ; Cabaret et al., 1986) possèdent une bourse caudale à l'extrémité postérieure de leur corps, tandis que les femelles plus volumineuses (11,2 mm ; Cabaret et al., 1986) sont effilées à cette extrémité. Concernant les stades de vie libre, on remarque que les œufs sont de forme ovoïde, et mesurent en moyenne 91,8 x 49,5 µm (Christie et Jackson, 1982). Enfin, les larves infestantes de troisième stade d'une longueur moyenne de 800 µm, sont caractérisées par une petite cavité buccale, un intestin à 16 cellules distinctes, et par une double cuticule.

  Epidémiologie de l'infestation par Teladorsagia circumcincta

Si la prévalence de cette espèce est toujours élevée (supérieure à 50%), il n'en est pas de même pour l'intensité d'infestation qui est fortement variable. Plusieurs facteurs intervenant dans cette variabilité peuvent être cités. Ainsi les strongles digestifs qui infestent préférentiellement les petits ruminants (ovins et caprins), sont pratiquement absents chez les bovins et les équins. Les agneaux sont plus réceptifs que les adultes (Cabaret, 1983), alors que les différences selon l'âge semblent moins tranchées chez les caprins (Richard et al., 1990). Enfin la sous-nutrition des chèvres qui influence directement l'état de santé des animaux, favorise les infestations par les strongles (Preston et Allonby, 1978). Des différences saisonnières sont également observées. Le printemps et l'automne constituent les périodes durant lesquelles le risque d'infestation est le plus fort en Europe pour la majorité des helminthes, ce qui s'explique par les conditions climatiques favorables au développement et à la survie des larves infestantes de troisième stade.

   Ecologie de Teladorsagia circumcincta

Le succès de chacune des étapes du cycle de développement de T. circumcincta dépend des conditions environnementales : - L'humidité et la température modifient la qualité et la quantité des stades libres. Le taux d'éclosion des œufs de T. circumcincta est optimal entre 15 et 25°C (Crofton, 1963). Un excès ou un manque d'eau au sein des matières fécales, diminuent le temps de survie des œufs et des larves L1 et L2 (Gruner et Suryahadi, 1993). Enfin lors d'une augmentation de la température, les larves de troisième stade sont beaucoup plus actives, ce qui diminue alors leur temps de survie sur le pâturage. - L'influence de l'environnement sur les stades parasitaires sera d'une autre nature, car la fertilité des femelles varie en fonction de l'espèce, et de la densité de vers présents. Le nombre d’œufs par femelle est inversement proportionnel au niveau d'infestation (Dajoz, 1974). Enfin, les réinfestations provoquent des mortalités dans les populations de vers adultes précédemment installées. Les interactions entre les diverses espèces localisées dans la caillette peuvent aussi jouer un rôle sur l’intensité des infestations (Cabaret et Hoste, 1998). En définitive, le succès de la phase de vie libre dépend surtout des conditions climatiques, alors que celui de la phase parasitaire est principalement lié aux interactions existant entre vers, qu'ils appartiennent ou non à la même espèce, mais aussi aux réactions de l'hôte.

   Pourquoi avoir choisi T. circumcincta comme modèle d'étude ?

La première justification au choix de T. circumcincta comme modèle d’étude, est lié au fait que la résistance aux benzimidazoles pourtant fréquente au niveau de sa zone d'endémie chez cette espèce, a fait l’objet d’un nombre très limité d’études au niveau moléculaire. Les principaux travaux réalisés chez les trichostrongles sur la résistance à ces composés se rapportent en effet à deux autres espèces, H. contortus et T. colubriformis. La seule analyse réalisée chez T. circumcincta a été effectuée par Lehrer et al. (1995) et consiste en la mise au point d'une technique moléculaire permettant de détecter la résistance aux benzimidazoles chez T. circumcincta, ce travail n’ayant fait l’objet d’aucun développement ultérieur. Le second facteur ayant guidé notre choix est lié à la grande expérience accumulée par le laboratoire d'Ecologie des Parasites de l'INRA de Tours sur T. circumcincta, nous permettant notamment de disposer de plusieurs souches de ce parasite, dont on connaissait précisément l'origine, le niveau de résistance aux benzimidazoles et les conditions d’élevage des hôtes. Tout comme, nous disposions aussi des connaissances acquises sur ce nématode concernant son écologie, ses particularités morphologiques et génétiques (Gasnier, 1994). Enfin, choisir cette espèce permettait aussi de répondre à un impératif provenant d'un contexte géographique particulier, l'élevage caprins en région Centre étant l'un des plus importants en France. En 1984 l'effectif de ce cheptel caprin représentait 11,4% de l'effectif total, plaçant ce type d'élevage au troisième rang national juste derrière ceux des régions Poitou-Charentes et Rhône-Alpes.

L’ensemble de ces arguments ne suffit cependant pas à eux-seuls, à justifier le choix de T. circumcincta lors d'une étude sur la résistance aux benzimidazoles. Certaines particularités écologiques de cette espèce font qu'elle peut être considérée comme étant un modèle intermédiaire entre H. contortus et T. colubriformis. Ce point est d’un grand intérêt dans une perspective d’extrapolation des résultats obtenus aux autres espèces de strongles. En effet chez H. contortus, le niveau de ponte des femelles est souvent très important, alors que la survie dans le milieu extérieur des stades libres et celle des adultes chez l'hôte sont plutôt faibles. Chez T. colubriformis, le niveau de ponte des femelles et la survie des stades libres dans le milieu extérieur sont faibles, en revanche la survie des stades adultes chez l'hôte est importante. Par comparaison, T. circumcincta présente un niveau de ponte des femelles intermédiaire entre les deux autres espèces, une bonne survie des stades libres dans le milieu extérieur, et une survie moyenne des adultes chez l’hôte. D'un point de vue pratique, étudier la résistance nécessite l'infestation expérimentale de ruminants dans le but de récupérer les formes adultes et larvaires du parasite. L'utilisation de l'espèce T. circumcincta permet de s'affranchir de certains problèmes rencontrés avec les deux autres espèces communes de strongles digestifs. Chez H. contortus, les populations de larves sont importantes mais les taux d'installation chez l'hôte sont très variables et plutôt faibles en moyenne, alors que les taux d'installation observés chez T. colubriformis sont réguliers et plus élevés.

   II. La lutte contre les strongles digestifs

La lutte contre les strongles digestifs peut concerner soit la phase de vie libre, soit la phase de vie parasitaire. Les moyens et les objectifs à atteindre dans ces deux cas seront de nature différente. Lors d'une action sur la phase de vie libre des nématodes, l'objectif principal est de réduire les sources de parasites, en diminuant le nombre d’œufs ou de larves infestantes présents sur la pâture. Le résultat espéré est une diminution de l’infestation des ruminants par les strongles grâce à une réduction de la contamination du milieu extérieur. Cette réduction est possible soit par l'utilisation de méthodes de contrôle biologique, soit par une gestion appropriée du pâturage.

 Le contrôle biologique consiste à limiter la taille des populations d'une espèce en utilisant un autre organisme. Cependant la spécificité entre les deux organismes est une condition indispensable à l'utilisation d'un tel procédé, afin d'éviter que l'action de l'agent biologique utilisé ne soit néfaste à d'autres organismes. Dans ce domaine, les travaux les plus prometteurs concernent l'action des champignons hyphomycètes capables de piéger, puis d'éliminer les larves des strongles digestifs directement sur le pâturage. Ainsi Faedo et al. (1998) montrent qu'il est possible de réduire la taille des populations de L3 pour plusieurs espèces de strongles digestifs, en déposant sur la pâture des spores de Duddingtonia flagrans. Cette technique nécessite une introduction régulière de spores du champignon prédateur sur le terrain, ce qui limite quelque peu son utilisation. L'alternative adéquate est de rechercher les espèces dont les spores supportent le transit par le système digestif du ruminant, permettant un renouvellement de la population de champignon prédateur sur la pâture. Parmi les nombreuses espèces de champignons seule D. flagrans montre une grande capacité de survie aux processus digestifs du ruminant, le niveau de survie des chlamydospores chez d'autres espèces comme Arthrobotrys sp. étant trop faible (Llerandi-Juárez et Mendoza-de Gives, 1998). Depuis de récents travaux (Larsen et al., 1998) ont montré qu'il était possible d'obtenir une réduction notable du nombre de L3 récupérées dans les matières fécales d'un mouton ayant subis préalablement une infestation concomitante par une souche de T. colubriformis et une administration par voie orale de chlamydospores de D. flagrans (2.0 x 108 chlamydospores), résultats efficace seulement pendant les 24 premières heures. Pour obtenir une action sur une plus longue période, il faut pouvoir maintenir un fort niveau de présence des spores du champignon prédateur dans les matières fécales (ce qui à l'heure actuelle est l'un des points limitant de cette stratégie). Les équipes travaillant sur ce domaine recherchent un processus à la suite d'une seule et unique administration permettant un relargage progressif des spores au niveau de l'appareil digestif des ruminants. Ce moyen de lutte ne représente donc pour l'instant qu'un complément aux autres méthodes de lutte déjà en application ; elle serait intéressante à développer lors des périodes à haut risque d'infestation parasitaire.

 La gestion des pâturages représente le deuxième moyen de lutte contre les strongles digestifs basé sur l'intervention directe sur la phase de vie libre (Gruner et Cabaret, 1985). Ce procédé est intéressant car il est rapide à mettre en place et d'un coût très limité pour l'éleveur. Son principe consiste à placer les animaux sur des parcelles peu ou pas contaminées par les strongles digestifs. Plusieurs méthodes sont employées pour obtenir une parcelle saine, comme la mise en repos prolongé ou le retournement régulier (tous les deux ou trois ans) des prairies lors des labours. De même, la création d'un système de pâturage mixte ou alterné, par plusieurs espèces d'hôtes (ovins puis bovins par exemple) permet sous certaines conditions, de limiter l'infestation des pâturages. Ce dernier procédé nécessite une forte spécificité du parasite pour son hôte ce qui limite son utilisation car plusieurs espèces de strongles, dont Trichostrongylus axei et Trichostrongylus colubriformis infestent l'ensemble des ruminants domestiques. Le même principe de pâturages mixtes peut être proposé pour une seule espèce d'hôtes, mais il nécessite de placer les jeunes ruminants "sensibles" avant les hôtes adultes "résistants" sur la parcelle saine. Cette ultime possibilité est à l'étude chez les bovins et les ovins ou il existe une différence nette de sensibilité entre les animaux jeunes et les adultes pour l'infestation par les strongles digestifs. Les objectifs à atteindre lors de l'action sur la phase parasitaire sont différents et reposent soit sur le contrôle de l'installation du parasite chez le ruminant, soit sur l'élimination des vers déjà installés chez l'hôte.

 La vaccination peut être un moyen de limiter le niveau d'infestation des ruminants domestiques par les strongles digestifs (Newton, 1995). De nombreux travaux sur la réponse immunitaire des ruminants sont entrepris mais les résultats obtenus sont encore très préliminaires vers une perspective vaccinale. Le seul existant et commercialisé à ce jour est un vaccin vivant atténué contre la dictyocaulose bovine, dont l'usage demeure très restreint. Ce constat suggère que les problèmes rencontrés lors de la mise au point d'un vaccin contre l'ensemble des strongles digestifs sont importants. De plus, cet outil devra être polyvalent, les infestations naturelles par les strongles étant plurispécifiques. - Une démarche analogue pour contrôler l'infestation est d'utiliser la résistance innée de certaines races de ruminants aux strongles digestifs ou celle de certains individus au sein d'une race. Pour exemple chez les chèvres, il a été montré que l'excrétion d’œufs par les strongles digestifs était moins importante chez les animaux de race Alpine que chez ceux de race Saanen (Richard et al., 1990). Concernant la seconde alternative, il est nécessaire dans un premier temps d'effectuer une sélection sur les individus les plus résistants aux infestations par les strongles digestifs, tout en s'assurant dans un second temps que ces animaux ne présentent pas une sensibilité accrue pour d'autres pathogènes ou des aptitudes zootechniques différentes de celles désirées. De tels travaux sont actuellement développés dans notre laboratoire (Gruner et Lantier, 1991 ; Mandonnet et al., 1997 ; Aumont et al., 1998 ; Bouix et al., 1998). - La troisième possibilité d'action sur la phase parasitaire des strongles digestifs est l'utilisation d'anthelminthiques. Ce moyen de contrôle est actuellement le plus répandu chez les éleveurs. Il fera l'objet d'un développement important dans le paragraphe suivant.

   III. Les anthelminthiques

En 1938, la Phénothiazine fut découverte et les premiers résultats positifs de son utilisation furent rapportés sur des nématodes parasites de ruminants et de chevaux (Roberson, 1982 ; Lanusse et Prichard, 1993). Mais aux Etats-Unis, on observa rapidement chez H. contortus une résistance à ce produit dès le milieu des années 50. La Phénothiazine n'est plus utilisée à l'heure actuelle, non par la présence de résistance à ce produit, mais parce que d'autres composés, plus faciles d'utilisation et présentant un spectre d'action plus large, sont disponibles. La recherche de nouveaux produits fut donc intense, jusqu'à l'introduction en 1961 d'un benzimidazole, le thiabendazole qui présentait un large spectre d'action (Brown et al., 1961).

   III. 1. Classification des anthelminthiques

Le mode d'action des anthelminthiques permet d'obtenir une classification (Tableau 1) assez simple de ces molécules dans laquelle on distingue les composés se fixant sur un canal ionique de la membrane du parasite de ceux qui interagissent avec d'autres cibles "biochimiques" du parasite (Martin et al., 1997). Les anthelminthiques les plus utilisés sont les benzimidazoles, les imidazothiazoles dont le Lévamisole et le Tétramisole, les tétrahydropyrimidines et les lactones macrocycliques. Il existe enfin deux autres groupes de composés moins fréquemment utilisés, qui sont les salicylanilides, dont le Closantel et les organophosphorés, comme le Naphthalophos (Waller, 1986).

Tableau 1 : Classification des anthelminthiques en fonction de leur site d'action chez les divers helminthes.

Action des anthelminthiques sur des cibles biochimiques Famille de molécule Cible Noms génériques Benzimidazoles ß-tubuline Thiabendazole, Cambendazole, Oxibendazole, Albendazole, Fenbendazole, Oxfendazole, Mebendazole Pro-benzimidazoles ß-tubuline Thiophanate, Febentel action sur les nématodes, cestodes et trématodes Salicylanilides protons ionophores Closantel, Rafoxanie, Oxyclozanide, Niclosamide, Dibromosalan action sur le nématode Haemonchus contortus Organophosphorés choline-estérase Dichlorvos, Trichlorphon, Naphtalophos action sur les nématodes et les insectes

Action des anthelminthiques sur les canaux inoniques Famille de molécule Cible Noms génériques Imidothiazoles récepteur à l'acétylcholine Lévamisole, Tétramisole action sur les nématodes Tetrahydropyrimidines récepteur à l'acétylcholine Morantel, Pyrantel action sur les nématodes Lactones Macrocycliques canaux à chlore Ivermectine, Abamectine, Doramectine, Mosidectine action sur les nématodes et les insectes parasites récepteur à l'acide gamma amino-butyrique (GABA) Pipérazine action sur les nématodes

   III. 2. Quelques notions sur la structure et la biochimie des benzimidazoles

La structure de base (figure 2) des benzimidazoles est un cycle double correspondant à la fusion d'un noyau benzène et d'un hétérocycle, un imidazole (Towsend et Wise, 1990). Les modifications des groupements fixés en position 2 et 5 de cette structure permettent d'obtenir les différents composés de cette famille d'anthelminthique (Towsend et Wise, 1990) comme le thiabendazole ou (2-(4'-thiazolyl)benzimidazole). Certains problèmes d'hydroxylation enzymatique du thiabendazole provoquant une inactivation ou une baisse d'efficacité de ce composé (Hoff et al., 1970), sont à l'origine de la diversification des composés de cette famille d'anthelminthique, les modifications de la structure en position 5 du noyau principal permettant de prévenir cette inactivation. La solubilité limitée dans l'eau et l'absorption médiocre des benzimidazoles (BZs) diminuent les possibilités d'utilisation de ces composés contre les nématodes gastro-intestinaux. En réponse à ce second problème, différentes prodrogues ont été élaborées. Ces composés présentent non seulement une meilleur solubilité, mais elles sont aussi moins toxiques pour l'hôte (Horton, 1990). Les prodrogues sont formées d'un noyau benzénique sur lequel sont placés différents groupements carbonés. Ces groupements seront convertis en imidazole par certaines enzymes, permettant d'obtenir la drogue active (ou carbamates de Bzs), après l'absorption du composé par le ruminant (Towsend et Wise, 1990). L'efficacité des prodrogues dépend du rendement et du lieu (rumen, intestin etc.) de formation du composé actif (Gottschall et al., 1990). Les principales prodrogues utilisées sont le Thiophanate, le Febentel, le Netobimin et le Benomyl. Les mécanismes permettant l'élimination des benzimidazoles sont importants à connaître car les produits secondaires formés lors de la dégradation d'une drogue sont parfois beaucoup plus toxiques que le composé initial. La métabolisation des benzimidazoles qui dépend de la solubilité de ces composés, se décompose en deux phases. Le noyau aromatique principal et les chaînes carbonées associées seront modifiés par différents mécanismes d'hydroxylation, d'S-oxydation ou de réduction, permettant d'augmenter la solubilité de la forme initiale de la drogue. Lors d'une seconde phase, les produits obtenus seront conjugués à d'autres substances naturelles (acides aminés, hydrates de carbone, sulfates, sels biliaires ou gluthation), favorisant leur élimination par l'organisme (Gottschall et al., 1990). En fonction des substitutions au niveau des carbones 2 et 5 du noyau principal, les voies métaboliques des benzimidazoles seront légèrement différentes. - Ainsi 97% d'une dose de thiabendazole (Tbz) administrée par voie orale est récupérée, sous forme de 5-OH-Tbz conjuguée ou libre, au bout de 7 jours (60% dans les urines et 37% dans les fèces). Seul 0,1% de la forme initiale du composé est détectée dans les urines (Tsuchiya et al., 1987). L'hydroxylation du noyau aromatique du thiabendazole est catalysée par le cytochrome P-450, une enzyme de première importance dans les mécanismes d'élimination des toxiques. - La métabolisation du fenbendazole (Fbz) s'effectue principalement par S-oxydation du noyau aromatique, produisant le sulfoxide ou oxfendazole (Short et al., 1987). Chez les bovins, par voie intraveineuse, 50 % de la dose est retrouvée non conjuguée dans les fèces sous forme de Fbz-OH, tandis qu'une faible proportion du composé initial est récupérée dans les urines. Par voie orale, seul 36% de la forme initiale se retrouve dans les fèces, aucune trace n'apparaissant dans les urines. Chez les caprins, les métabolites résultants de la dégradation du fenbendazole sont identiques. Seules les proportions récupérées dans les urines et dans les fèces évoluent ; elles sont respectivement de 15% et de 46% après intraveineuse ou de 5% et de 68% lors de l'administration du composé par voie orale. L'étape initiale de sulfoxidation du fenbendazole est réversible, ce qui permet le maintien d'un équilibre entre ce composé et l'un de ses dérivés, l'oxfendazole. L'exemple du fenbendazole est important, car il montre que la métabolisation d'un toxique varie en fonction de la méthode d'administration du composé et de l'espèce animale traitée. Selon leur forme active, les voies métaboliques empruntées par les prodrogues sont différentes. Pour le Benomyl, plus de 99% de la dose administrée par voie orale est éliminée au bout de 72 heures (86% dans les urines et 13% dans les fèces) sous forme de métabolites libres ou conjugués, correspondant à ceux observés pour un autre composé, le thiabendazole. Aucune forme initiale du Benomyl n'est retrouvée (Gardiner et al., 1974). Le Netobimin, une autre prodrogue subit la même voie métabolique que sa forme active l'albendazole (Delatour et al., 1986). Initialement le premier rôle suspecté des benzimidazoles fut une action sur la fumarate réductase, une enzyme du cycle de Krebs intervenant dans le métabolisme anaérobie du glucose (Prichard, 1973). Depuis, de nombreux travaux ont montré que les benzimidazoles sont surtout des antimitotiques qui détruisent le réseau de microtubules du parasite sans altérer celui de l'hôte (Lacey, 1988). Il convient donc de rappeler différents éléments sur les microtubules et sur la tubuline nécessaires à la compréhension du mode d'action des benzimidazoles.

   III.3. Les microtubules et la tubuline

Le cytosquelette des cellules eucaryotes est formé de plusieurs types de filaments, dont les microtubules. Les fonctions architecturales ou contractiles du réseau de microtubules sont diverses. Elles permettent notamment les mouvements des vésicules excrétrices au sein du cytoplasme des cellules. Les microtubules assurent aussi le maintien de la morphologie cellulaire et des propriétés de surface. Le rôle contractile du réseau de microtubules intervient dans la mobilité des flagelles et dans la migration et l'élongation des cellules nerveuses. Enfin cette structure est à l'origine de la formation du fuseau mitotique des cellules en division, permettant la migration des chromosomes. Les microtubules sont des structures cylindriques creuses de 24 nm de diamètre, 5 nm d'épaisseur et formés de deux types de sous-unités homologues d'a- et de b-tubulines. Le nombre de protofilaments constituants la trame d'un microtubule varie en fonction de l'espèce et des conditions in vitro d'assemblage (Lacey, 1988). Par microscopie électronique, on s'aperçoit que les microtubules sont constitués de 13 protofilaments de tubuline chez les mammifères, alors qu'une structure à onze protofilaments est plus commune chez les nématodes, notamment chez Caenorhabditis elegans (Chalfie et Thomson, 1979) et chez Trichostrongylus colubriformis (Davis et Gull, 1983). Ce réseau de microtubules, interne à la cellule n'est pas figé. L'élongation de chaque filament est réalisée par la polymérisation à l'un des pôles des dimères de tubuline, pendant que l'extrémité inverse se dépolymérise (Lacey, 1990). Cet équilibre dynamique du réseau de microtubules sera modifié par différents cofacteurs, comme le GTP (Guanosine Tri-Phosphate) et le Magnésium favorisant le processus de polymérisation ou le Calcium augmentant celui de dépolymérisation (Lacey, 1988). La stabilité du réseau est enfin assurée par de nombreuses protéines ou MAPs (Microtubule Associated Protein).

Le dimère de tubuline, qui est l'unité de base des microtubules, représente l'association de deux protéines, l'a- et la b-tubulines, d'un poids moléculaire d'environ 50 000 daltons chacune et comprenant respectivement 450 et 455 acides aminés. L'homologie entre les deux polypeptides est selon l'espèce comprise entre 36 et 42%, suggérant que ces deux protéines proviennent de la duplication d'un gène ancestral commun (Little et Seehaus, 1988). L'a- et la b-tubuline sont présentes dans le génome sous la forme d'une famille multigénique (Cleveland et Sullivan, 1985), dont la variabilité des diverses isoformes s'exprime principalement au niveau de la portion C-Terminale ou selon les modifications post-traductionnelles quelles subiront (Sullivan, 1988). L'hétérogénéité de la tubuline permet à la cellule d'obtenir de nombreuses combinaisons, des différentes formes de cette protéine, au niveau des dimères de tubuline, nécessaire à la réalisation des différentes fonctions du réseau de microtubules. Le nombre et la disposition des gènes de l'a- et de la b-tubulines seront différents selon l'espèce. Chez Chlamydomonas reinhardtii, une algue unicellulaire, il existe deux gènes d’a et deux gènes de la b-tubuline, regroupés dans le génome sous la forme d'une séquence dupliquée en tandem, alors que chez Drosophila sp., on dénombre 4 gènes différents pour ces deux protéines, dispersés dans le génome. (Cleveland et Sullivan, 1985). Concernant les organismes supérieurs, comme les mammifères le nombre de gènes de la tubuline est beaucoup plus important (de 15 à 20 gènes identifiés chez l'homme). Ces gènes sont dispersés dans le génome et certaines de leurs séquences correspondent à des pseudogènes contenant de multiples délétions ou inversions. L'origine et la fonction de ces séquences altérées de la tubuline sont encore inconnues. Chez l'homme sur les 20 séquences répertoriées seules deux semblent fonctionnelles (Cleveland et Sullivan, 1985). A l'inverse de la variabilité intraspécifique importante des isoformes de la tubuline, on remarque que les séquences de l'a- et de la b-tubulines sont très conservées. Le polypeptide de la b-tubuline du cerveau chez le porc est à 99% identique à celui chez le poulet (Cleveland et Sullivan, 1985). La plupart des différences observées au niveau de la séquence nucléotidique de ces gènes sont donc silencieuses, faisant de la tubuline l'une des protéines les plus conservées du règne animal.

   III.4. Le mode d'action des benzimidazoles

Toute modification de l'équilibre dynamique de la structure des microtubules provoquera une cascade de changements biochimiques et physiologiques dans la cellule qui seront à l'origine de la perte de l'homéostasie cellulaire, phénomène létal pour la cellule. Cet équilibre entre la forme polymérisée et dépolymérisée des microtubules sera altéré par plusieurs inhibiteurs qui se fixent sur la tubuline et empêchent l'association spontanée des dimères en microtubules. Ce mécanisme de "capping" des sous-unités de tubuline associée à la dépolymérisation du microtubule au pôle opposé provoquera une diminution de la longueur du filament et donc une déstructuration complète du réseau. Parmi les inhibiteurs les plus connus, on peut citer la vinblastine, la vincristine et la colchicine dont les sites de fixation se localisent sur le dimère de tubuline, alors que celui d'un autre composé, le taxol se trouve préférentiellement sur le microtubule (Lacey, 1988).

Les benzimidazoles : un inhibiteur des microtubules Le rôle des benzimidazoles comme inhibiteurs de la synthèse des microtubules fut mis en évidence pour la première fois lors d'études du mode d'action d'une prodrogue, le Bénomyl et de son composé actif, le Carbenazim chez des levures (Clemons et Sisler, 1971). La confirmation de ce mécanisme fut montrée par la désorganisation du réseau de microtubules des cellules intestinales d'Ascaris suum, mises en contact avec du mebendazole (Borgers et De Nollin, 1975). Cette inhibition se réalise par la fixation des benzimidazoles sur la tubuline (Lacey, 1990), au niveau d'un site proche de celui pour la colchicine, expliquant la compétition entre ces deux composés.

Pharmacologie de l'action des benzimidazoles sur les helminthes L'efficacité in vivo des benzimidazoles a été étudiée chez de nombreux helminthes (Campbell et Rew, 1986 ; van den Bossche et al., 1985). A partir de ces résultats, il est possible d'établir un certains nombre de principes : (1) Les différents composés de ce groupe d'anthelminthique peuvent être classés selon leur degré d'efficacité (en mg kg-1) in vivo de la façon suivante [TBZ < CBZ < PBZ < OBZ < MBZ < FBZ-ABZ-OFZ]*. Ces différences d’efficacité proviennent de la structure particulière de chacun de ces composés. La présence d'un groupement carboné (NHCOOCH2R) en position 2 du noyau principal est essentiel dans l'activité des benzimidazoles. Le remplacement de cette structure par une amide (NHCOCH2R) diminue de 10 fois l'efficacité du produit. * Thiabendazole (TBZ), Carbenazim (CBZ), Parbendazole (PBZ), Oxibendazole (OXB), Mebendazole (MBZ), Fendazole (FBZ), Albendazole (ABZ), Oxfendazole (OFZ). (2) La dose nécessaire contre les nématodes gastro-intestinaux selon le produit est de 5 à 44 mg kg-1 chez les ovins, de 4.5 à 66-100 mg kg-1 chez les bovins et de 10 à 80 mg kg-1 chez les caprins (Mariner et Armour, 1986). (3) Différentes expériences de mise en contact entre les benzimidazoles et les différents stades de développement des nématodes gastro-intestinaux, ont montré des variations du degré d'efficacité de ces composés. Concernant les stades de vie parasitaire, les benzimidazoles sont plus efficaces sur les formes adultes du parasite que sur les L4 et les formes immatures, ces composés au niveau des stades de vie libre présentant un degré d'action plus important sur les œufs et les larves L1, que sur les larves L3 (Cabaret, communication personnelle). Les mécanismes permettant l'éclosion des œufs et leur développement en larves de premier stade sont inhibés par certaines doses de benzimidazole, qui utilisées sur les formes adultes sont inefficaces (Kirsch et Schleich, 1982), ce qui tend à prouver que ces composés sont généralement plus actifs sur certains stades de vie libre du parasite que sur ceux de vie parasitaire.

Une action spécifique des benzimidazoles sur le parasite Les benzimidazoles (BZs) sont des composés actifs contre les nématodes et les levures, mais présentent une toxicité très limitée chez les mammifères. Ainsi, l'inhibition de la polymérisation des microtubules par le FBZ et le MBZ est respectivement 250 fois et 400 fois plus importante chez Ascaris suum en comparaison de celle observée chez les mammifères (Friedman et Platzer, 1980), suggérant que la spécificité d'action des BZs provient d'une plus grande affinité de ces composés pour la tubuline des helminthes. Le "capping" des dimères de tubuline chez les mammifères étant insuffisant, il n'y aurait peu ou pas d'inhibition de la polymérisation (Lacey, 1990). Cependant certains travaux (Köhler et Bachmann, 1981) n'ayant révélés aucune différence d'affinité de la fixation des BZs sur de la tubuline d'helminthes ou de mammifères, concluent que leur spécificité d'action s'explique par des différences d'ordre pharmacocinétique, liées à un manque de stabilité du complexe formé lors de la fixation des BZs sur la tubuline des mammifères. Différentes expériences montrent que le complexe résultant de la fixation de plusieurs BZs (MBZ, FBZ etc.) sur la tubuline est pseudo-irréversible chez H. contortus (Lacey et Prichard, 1986) et très stable chez Aspergillus nidulans (Davidsee et Flach, 1977). Enfin, des résultats récents obtenus par Russell et al. (1992a) montrent que la fixation entre les BZs et la tubuline est thermodépendante. A 37 °C, la formation de complexes pseudo-irréversibles est observée entre les BZs et la tubuline de nématode alors que de tels complexes sont observés avec la tubuline de mammifères à 4 °C. Ces différences s’expliqueraient selon les auteurs de ces travaux, par des changements conformationnels du dimère de tubuline induits par la température.

Si des différences d'affinité aux BZs existent entre tubuline de mammifères et tubuline de nématodes, il en est de même entre tubulines de parasites. Ainsi, la dose de BZs efficace contre les cestodes et les trématodes est plus forte que celle utilisée contre les nématodes (van den Bossche et al., 1982), ce qui traduit une spécificité d'action de ces composés selon les espèces. La fixation pseudo-irreversible des BZs sur la tubuline des parasites peut devenir réversible lorsque certaines conditions (dégradation rapide du produit par l'hôte et turn-over important des sous-unités de tubuline chez les parasites) sont réunies. Comme ces deux processus sont généralement plus lents que ceux permettant la dissociation du complexe tubuline-BZs, l'efficacité du composé dépendra du temps d'élimination du parasite de son site chez l'hôte. Si l'élimination des parasites est plus rapide que les processus de dissociation du complexe, ce qui est le cas chez les nématodes gastro-intestinaux, l'efficacité des BZs sera très bonne (même si le niveau de stabilité du complexe est faible). A l'inverse chez d'autres parasites (Fasciola hepatica et Taenia sp.), les mécanismes d'élimination des vers étant beaucoup plus lents, on s'aperçoit que l'efficacité des BZs est réduite. Il y a dissociation du complexe et synthèse de nouveaux microtubules avant l'élimination des parasites (Lacey, 1990).

   IV. La résistance aux anthelminthiques

La résistance est définie comme étant une réduction héritable de la sensibilité d'une population d'individus à l'action d'une drogue. Elle s'exprime par une baisse de la fréquence des individus affectés après l'exposition au composé, en comparaison de la fréquence observée initialement dans la même population avant la première exposition (Conder, 1995). Cette définition peut être appliquée pour toutes les populations quel que soit l'organisme vivant (plantes, insectes, virus et parasites). La résistance ne doit pas être confondue avec la tolérance qui représente la réponse innée d'une population aux effets d'une drogue indépendamment d'expositions antérieures.

   IV. 1. Situation de la résistance aux anthelminthiques dans le monde

Faire une description précise de la situation de la résistance aux anthelminthiques dans le monde semble impossible à réaliser ou du moins risque d'être incomplète, en raison de la grande diversité des molécules utilisées, des nématodes parasites et des hôtes, mais aussi en raison du très grand nombre d'articles publiés. En revanche, une lecture attentive des différentes synthèses publiées sur ce sujet permet de dégager plusieurs éléments décrivant assez bien la situation de la résistance à ces composés dans le monde et notamment celle concernant la résistance aux benzimidazoles chez T. circumcincta.

1) Pourquoi la situation est-elle plus critique dans certains pays ?

De nombreux cas de résistance aux trois principaux groupes d'anthelminthiques (benzimidazoles, imidazothiazoles et lactones macrocycliques) sont observés dans les élevages ovins et caprins d'Australie (Waller, 1997), d'Afrique du Sud (van Wyk, 1990) et de certains pays d'Amérique du Sud, comme le Paraguay (Maciel, 1996). La taille importante des élevages, les conditions climatiques particulières permettant un maintien continu du cycle de développement des strongles digestifs au cours de l'année et l'utilisation trop fréquente des anthelminthiques sont autant d'éléments communs à ces pays et favorables au développement de la résistance. L'une des conséquences de ce phénomène a été la cessation d'activité chez certains éleveurs d'ovins en Afrique du Sud (van Wyck, 1990) et de caprins en Australie (Waller, 1997), aucune molécule n'étant plus efficace pour lutter contre les strongles digestifs. Inversement l'absence de résistance détectée dans certains pays d'Asie ou d'Afrique peut s'expliquer soit par un manque d'investigations sur le sujet, soit parce que l'utilisation d'anthelminthiques dans ces pays est limitée, les dépenses nécessaires pour traiter les animaux d'un troupeau pouvant être trop importantes pour les éleveurs de ces régions. Dans les pays de la Communauté Européenne comme la France (Chartier, 1998), le Danemark (Maingi, 1996) et le Royaume-Uni (Coles, 1998), la résistance augmente d'une façon générale au cours de ces dernières années, mais demeure principalement liée à l'utilisation des BZs dans les élevages de chèvres et de moutons et dans une moindre mesure à celle du lévamisole dans les élevages ovins. La situation n'est pas aussi préoccupante que celle décrite en Australie ou en Afrique du Sud, mais peut le devenir rapidement, notamment dans les élevages caprins ou l'utilisation systématique des BZs favorise le développement important de résistances à ces composés.

2) Pourquoi parmi les anthelminthiques, la résistance aux BZs est-elle la plus répandue?

L'une des raisons est historique, car les BZs furent les premiers anthelminthiques à large spectre d'action utilisés dans la lutte contre les strongles gastro-intestinaux. Par rapport aux autres groupes comme les imidazothiazoles ou les lactones macrocycliques, les BZs sont bon marché, ce qui peut influencer les éleveurs dans l'utilisation exclusive et abusive (traitements réguliers) de ces composés. De plus ces molécules laissent peu de résidus dans le lait ce qui justifie leur choix par les producteurs laitiers.

3) Pourquoi la résistance aux anthelminthiques varie-t-elle selon l'espèce de ruminant ?

Il existe en effet des différences dans le nombre de cas recensés de résistance suivant les espèces hôtes. Chez les nématodes de bovins, le nombre de cas de résistance recensés est très faible, alors qu'il est très élevé chez les nématodes de caprins. Hosking et al. (1996) mentionnent seulement 5 cas de résistance chez les bovins en dehors de celui qu'ils décrivent. Dans les pays européens le nombre de traitements des bovins est restreint ce qui pourrait expliquer le moindre développement de la résistance. Mais le même phénomène s’observe aussi dans des zones où de nombreux traitements sont effectués (tous les mois dans la Pampa humide d'Argentine, Costa et Suarez, communication personnelle). Il semble donc que la nature de l’hôte intervienne dans la possibilité de sélection de phénotypes résistants, notamment par rétention plus importante des BZs ou par une durée de demi vie de ces composés plus longue chez les bovins que chez les autres ruminants, permettant une action prolongée des BZs (Short et al.,1987).

4) La résistance est-elle décrite chez toutes les espèces de strongles parasites ?

Aucune enquête épidémiologique n'a mis en évidence de différences dans le développement de la résistance aux anthelminthiques entre les diverses espèces connues. En revanche la composition des peuplements de strongles digestifs d'un hôte est sous influence directe de divers facteurs dont nous avons parlé lors de la présentation des strongles digestifs. L'apparition de la résistance aux anthelminthiques pour une espèce de strongles digestifs dépend donc uniquement de sa présence et des pratiques d'élevages favorisant ou non le développement de la résistance.

La distribution de la résistance aux anthelminthiques chez T. circumcincta, assez bien documentée, permet d'illustrer ce propos (Figure 3). Ce nématode est absent de la zone tropicale mais en revanche très présent dans tous les pays des zones de climats tempéré ou froid. Dans l'hémisphère Nord, de nombreux cas de résistance aux BZs ont été signalé chez ce nématode, notamment aux Etats-Unis (Miller et Baker, 1980) et dans les pays de la Communauté Européenne comme le Danemark (Bjørn et al., 1991), la France (Chartier et al., 1998), l’Allemagne (Düwel, 1991), les Pays-Bas (Borgsteede, 1996), le Royaume-Uni (Coles et al., 1998), et la Tchécoslovaquie (Varady et al., 1993). Dans ces pays, le nombre élevé de traitements pratiqués par certains éleveurs explique le développement de ces résistances. En revanche, aucune résistance aux BZs n'est observée en Grèce (Papadopoulos et al., 1993), en Espagne (Rojo-Vàsquez et Martinez-Fernàndez, 1993) et au Portugal (Caeiro, 1993) où les troupeaux ne reçoivent qu'un seul traitement par an. Dans l'hémisphère Sud la résistance aux BZs chez T. circumcincta s'observe en Australie (Waller, 1986), en Afrique du Sud (Louw et Reinecke, 1993 ; van Schalkwyk et al., 1983) et en Nouvelle-Zélande (Kettle et al., 1983) ; elle est combinée le plus souvent à une résistance au lévamisole et aux lactones macrocycliques.

   IV. 2. Mécanismes à l'origine du développement de la résistance à un toxique

Les possibilités d'adaptation permettant à un organisme vivant de devenir résistant à un composé toxique et de survivre aux doses normalement létales sont nombreuses, mais elles peuvent être classées en deux catégories principales (Taylor et Feyereisen, 1996). La première regroupe les mécanismes qui provoquent une diminution de la réponse face au produit, ce qui implique une modification du site d'affinité pour la drogue, alors que la seconde regroupe les mécanismes permettant de diminuer le temps d'exposition avec le produit obtenu selon différentes modalités comme les comportements d'évitement, de baisse de l'ingestion, des processus de détoxication, d'élimination ou de séquestration du produit toxique.

Si pour les BZs, les connaissances sur les mécanismes de résistance ont largement progressé depuis quelques années, il n’en est pas de même pour la résistance aux deux autres groupes d’anthelminthiques où l’on dispose de résultats encore très préliminaires. Concernant la résistance au lévamisole, un changement au niveau des caractéristiques de fixation des récepteurs (nicotinic acetylcholine receptors) a été observé chez Caenorhabditis elegans (Lewis et al., 1980). Sangster en 1996 a proposé l’hypothèse que l'action du lévamisole chez H. contortus serait détournée par une mobilisation plus importante du nombre de sites de faible affinité pour la drogue, site dont la fonction principale n'est pas modifiée. D'ailleurs, Hoekstra et al. (1997) n’ont observé aucune différence dans les séquences des gènes codant pour un récepteur à acetylcholine entre des vers résistants ou non au lévamisole. Concernant la résistance aux ivermectines, si l'acquisition de la résistance à ces composés se réalise par modification du récepteur, ces changements doivent se produire de la même façon sur deux types de récepteurs morphologiquement séparés (Sangster, 1996), ce qui semble peu probable. La résistance à ces composés doit faire intervenir d'autres mécanismes dont ceux permettant une augmentation des processus de détoxication du produit. Les P-Glycoproteines localisées sur la membrane de transporteurs, semblent intervenir dans l'expulsion de la drogue hors de la cellule (Xu et al., 1998). Ces deux exemples montrent que les schémas d'acquisition de la résistance aux anthelminthiques semblent très divers, les mécanismes de détoxication ayant à priori un rôle limité dans le développement de cette dernière (Barett, 1997).

   IV.3. Les mécanismes de résistance aux benzimidazoles

L'un des travaux les plus anciens sur l'étude de la résistance aux benzimidazoles chez les nématodes parasites du tractus digestif des ruminants fut réalisé en 1985 par l'équipe de Sangster. Ces recherches portaient sur les effets du thiabendazole sur les microtubules des cellules intestinales et sur les niveaux de sécrétions d'acetylcholinestérase, au niveau de deux isolats, l'un sensible, l'autre résistant aux BZs chez Trichostrongylus colubriformis. Leurs résultats furent les suivants :

- L'anthelminthique provoque une baisse de la sécrétion d'acetylcholinestérase dans la souche sensible de Trichostrongylus colubriformis, alors qu'elle demeure inchangée dans la souche résistante de ce nématode, la sécrétion d'acetylcholinesterase étant un mécanisme dépendant de l'action du réseau de microtubules.

- Le réseau de microtubules des cellules intestinales des vers de la souche sensible est détruit lors d'une exposition avec du thiabendazole, alors qu'il demeure intact chez les vers de la souche résistante.

Ces résultats montraient que l'affinité des BZs pour la tubuline était réduite chez les individus résistants, l'ingestion par le parasite du produit toxique étant la même dans les deux souches. Ils suggéraient aussi qu’un changement de la structure de la tubuline chez les vers résistants était à l'origine de cette réduction d'affinité. Les travaux de Lubega et Prichard (1990) sur l'étude de la fixation d'un BZ marqué radioactivement sur différents extraits de tubuline provenant de souches sensibles ou résistantes ont confirmé cette hypothèse en montrant qu'il y avait une baisse significative de la fixation de la drogue uniquement sur les préparations extraites à partir des populations résistantes.

Les connaissances sur les mécanismes de résistance aux BZs ont ensuite progressé grâce à l’apport des techniques de biologie moléculaire.

Premiers travaux sur les aspects moléculaires de la résistance aux BZs chez les nématodes

La première approche moléculaire sur la résistance aux BZs chez les nématodes fut réalisée par Driscoll et al. (1989) chez C. elegans. Les résultats de ces travaux montraient que 28 mutations sur le locus ben-1 du gène de la b-tubuline conféraient une résistance aux BZs et que certains individus résistants présentaient une délétion complète de ce gène ben-1. Ce travail fut suivi en 1990, par une étude réalisée sur H. contortus par Roos et al. dont le principal résultat fut de montrer l'existence d'une corrélation positive entre l'augmentation de la résistance aux BZs (mesurée par le test classique d'éclosion des œufs) et une baisse du polymorphisme de restriction de l’isotype 1 du gène de la b-tubuline chez ce nématode. De plus, cette réduction du polymorphisme du gène de la b-tubuline ne semblait pas résulter d'une baisse générale du polymorphisme de l'ADN dans les populations résistantes car aucune réduction du polymorphisme n’était observée dans ces populations au niveau des gènes d’a-tubuline ou d'actine. Ces résultats ne permettaient pas cependant d’exclure que la résistance soit en fait liée à des modifications sur un groupe de gènes étroitement lié à celui de la b-tubuline ou de mutation(s) intervenant sur plusieurs gènes. D’autre part, les fragments observés dans les profils de restriction des vers résistants se retrouvaient parmi ceux décris chez les vers sensibles, ce qui suggérait que les allèles résistants étaient présents dans les populations avant que les BZs ne soient utilisés, le développement de la résistance chez ce nématode pouvant se réaliser selon un processus rapide. Enfin en 1992, Geary et al. (1992) montra que l’on observait trois ADN complémentaires différents de la b-tubuline chez H. contortus, la résistance ou la sensibilité aux Bzs pouvant être associée à l'un des allèles dérivant de ces trois séquences. Suite à ces premiers travaux, plusieurs autres études furent réalisées sur l’étude du polymorphisme des gènes de la b-tubuline.

Polymorphisme comparé des gènes de la b-tubuline chez des nématodes résistants ou sensibles aux BZs.

Les travaux suivants ont confirmé les premières observations de Roos en apportant des précisions sur le rôle joué par les divers gènes de la b-tubuline dans la résistance aux BZs. Kwa et al. (1993a), Beech et al. (1994) ainsi que Lubega et al. (1994) confirmèrent chez H. contortus, que la résistance semblait liée à la sélection d’allèles particuliers de l’isotype 1 du gène de la b-tubuline. En revanche, des résultats contradictoires étaient exposés quant au rôle joué par l’isotype 2 de ce gène. Kwa et al. (1993a) n’observent aucune modification du polymorphisme de cet isotype en liaison avec la résistance mais ils constatent l’existence d’une délétion de cet isotype dans le cas de très fortes résistances. Beech et al.(1994) notent que la réduction du polymorphisme s’effectue sur les deux isotypes dans les populations résistantes et ils n’observent pas de délétion de l’isotype 2.
Enfin chez T. colubriformis, l'augmentation de la résistance aux BZs s'accompagne d'une diminution du polymorphisme du locus tcb-1 qui est identifié comme correspondant à l’isotype 1 du gène de la b-tubuline chez cette espèce (Grant et Mascord, 1996).
Parallèlement à ces travaux sur le polymorphisme de restriction, Kwa et al. (1993b) présenta une étude plus fine basée sur le séquençage des gènes de la b-tubuline, afin de rechercher la présence de mutations associées à la résistance à l’exemple des travaux de Driscoll et al. (1989) réalisés sur C. elegans.

Les mutations associées à la résistance aux BZs

La première association entre la résistance aux BZs et l’existence de mutations sur le gène de la b-tubuline a été réalisée chez les champignons. En effet, les BZs étaient tout d’abord des fongicides et les premiers problèmes de résistance à ces molécules sont apparus chez ces organismes. Chez ces espèces, différentes mutations du gène de la b-tubuline ont été associées à la résistance aux BZs :

- L'analyse des gènes de la b-tubuline chez des souches résistantes au benomyl de Saccharomyces cerevisiae montre que ce phénotype est associé au changement d'une Arginine par une Histidine en position 241 (Thomas et al., 1985), tandis que le changement d'une Alanine par une Valine en position 165 permet chez Aspergillus nidulans, d'obtenir une résistance au thiabendazole, mais une hypersensibilité au benomyl. (Jung et Oakley, 1990).

- Chez Neurospora crassa (Orbach et al., 1986), la résistance est liée au changement d'une Phénylalanine par une Tyrosine, en position 167 de la b-tubuline, tandis que ce même changement (Koenraadt et al., 1992) intervient au niveau de l’acide aminé 200 chez d'autres espèces (Aspergillus nidulans, Venturia inaequalis, Venturia pirina, Monilinia fructicola, Sclerotinia homoeocarpa et six espèces de Penicillium).

Conjointement on remarque que le 200 ème acide aminé du gène ben-1 chez C. elegans est une Phénylalanine, tandis que tub-1 possède une Tyrosine à cette position (Driscoll et al. 1989). Kwa et al. (1993b, 1994) font la même observation chez H. contortus ainsi que chez T. colubriformis et un travail préliminaire de Lehrer et al. (1995) suggère le même résultat chez T. circumcincta. A l’issue de ces travaux, il semble donc que la présence d'une Phénylalanine en position 200 du gène de la b-tubuline soit liée à la sensibilité aux BZs aussi bien chez les nématodes que chez les levures (Jung et al., 1992) et les protozoaires (Edling et al., 1994).

Le fait de retrouver la même mutation associée à la résistance aux BZs chez des organismes très différents semble suggérer que cette mutation a un rôle fonctionnel dans la résistance aux BZs et qu’elle ne constitue pas un simple marqueur associé à ce phénomène. Ce rôle fonctionnel a été démontré lors d'expériences de transfection chez C. elegans de gènes de b-tubuline mutant (Tyr) ou sauvage (Phe) isolés chez H. contortus (Kwa et al., 1995). L'introduction d'un fragment de l'isotype 1 du gène de la b-tubuline possédant une Phénylalanine à l’acide aminé 200 permet de restituer une sensibilité au Tbz chez une souche de C. elegans à l'origine mutée pour ben-1 et donc initialement de phénotype résistant. En revanche l'expérience inverse consistant en l'introduction d'un fragment comprenant une Tyrosine en position 200 n'a aucune influence sur le phénotype d'une souche sauvage de C. elegans sensible aux BZs. Ce second résultat semble montrer que la mutation conférant la résistance est récessive.

Comment expliquer le rôle fonctionnel de cette mutation dans la résistance aux BZs ? Trois mécanismes peuvent être proposés :
(1) Une diminution de l'affinité de la drogue pour sa cible est liée aux changements de conformation induits par la mutation.
(2) L'affinité de la drogue pour sa cible reste la même mais il n’y a pas de formation d'un complexe stable entre la drogue et son récepteur.
(3) Le niveau de polymérisation des microtubules ou leur degré de stabilité augmente, la mutation permettant une meilleure fixation du GTP.

Il est actuellement impossible de choisir parmi ces trois hypothèses. Il faut noter cependant que l'acide aminé 200 est très proche d’un site de fixation du GTP qui est un facteur favorisant la polymérisation du réseau de microtubules. Cette observation est à rapprocher de résultats montrant que la résistance aux antimitotiques peut provenir d'une augmentation de la polymérisation des microtubules ou d'une meilleure stabilité du réseau (Minotti et al., 1991). Enfin, il ne faut pas exclure de possibles interactions avec d'autres parties du gène de la b-tubuline comme l’extrémité C-terminale (Kwa et al., 1995).