Thèse Pascale Joubert
Introduction

 

2. Le RHDV

2.1 Histoire

Le Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV) est responsable d'une maladie hautement contagieuse et fatale chez les lapins domestiques et sauvages. Cette maladie est apparue pour la première fois en Chine en 1984 puis en Corée en 1985 . En 1986, une épizootie a touché le continent européen à partir de 2 foyers, l'Italie et l'Europe de l'Est . Depuis, cette maladie a atteint de nombreux pays européens tels que l'Espagne , la France , la Grande Bretagne , l'Irlande entraînant d'importantes pertes économiques liées à la décimation des élevages de lapins fermiers mais aussi une mise en danger des lapins sauvages. Aussi, dès 1989, l'Office International des Epizooties déclara la maladie hémorragique du lapin comme faisant partie de la liste B des maladies contagieuses . Une étude épidémiologique réalisée en France, où la maladie est endémique, sur la période de 1988 à 1995 a montré que le panel des isolats français était issu d'une épizootie (1988-1989) causé par l'entrée en France de 2 génotypes différents, un par le sud (Italie) et un par l'est (Allemagne) .

Cette maladie a aussi affecté d'autres continents. En 1988, elle a été introduite au Mexique par l'intermédiaire de carcasses infectées provenant de Chine. La mise en place d'un programme d'éradication établit en 1989 par le National System for Animal Health Emergencies a permis l'élimination complète de la maladie dès 1992 . Plusieurs pays africains ont également rapporté des épizooties dans les élevages de lapin . En Australie, le RHDV a été étudié comme un moyen de lutte biologique pour limiter la population de lapins, ceux ci étant considérés comme une nuisance pour l'environnement. En 1995, le RHDV a été "malencontreusement" introduit en Australie à partir de l'île de Wardang où il était étudié sur des enclos expérimentaux de lapins puis de façon illégale en Nouvelle Zélande en 1997 .

Parallèlement, il a été rapporté une maladie ayant les mêmes caractéristiques que la maladie hémorragique du lapin mais hautement mortelle chez le lièvre brun sauvage et domestique . Cette maladie est en fait due au European Brown Hare Syndrome Virus (EBHSV). Le EBHSV et le RHDV sont en fait 2 virus hautement affiliés qui forment le genre lagovirus de la famille des Caliciviridae (Tab. 1). De plus, il a été montré que ces 2 virus étaient 2 sérotypes d'un même sérogroupe viral .

2.2. Pathologie

    2.2.1. Tableau clinique/cytopathologie

Les signes cliniques et les lésions décrits lors de la maladie hémorragique du lapin sont étonnamment sévères et très différents des autres calicivirus humains ou du genre vésivirus. Les symptômes de cette maladie sont peu évocateurs, d'apparition brutale et ils évoluent rapidement. Les lapins infectés peuvent présenter des signes d'anorexie, de difficultés respiratoires, d'opisthotonos et un saignement du nez avec une progression rapide (72h) vers la mort . L'autopsie révèle une obstruction thrombotique sévère des vaisseaux principaux tels que les artères pulmonaire, supra hépatique et aortique. Il s'agit d'une coagulation intravasculaire disséminée, caractéristique des fièvres hémorragiques virales. Elle est aussi la cause majeure de la pathogenèse et donc de l'atteinte sévère hépatique et pulmonaire . Des observations histopathologiques ont permis de détecter chez les lapins infectés une atteinte du foie et de la rate 30h pi, du thymus et des amygdales 36h pi et, des poumons, des ganglions lymphatiques et des reins 48h pi . La détection de l'ARN viral par RT-PCR dans les différents tissus atteints montre la présence dès 18h pi du RHDV dans le foie et la rate . Il est important de noter que les lapins de moins de 2 mois ne sont pas sensibles au RHDV .

Les lésions hépatiques sévères sont la conséquence d'un tropisme du virus pour les hépatocytes . Les cellules infectées par le RHDV dans les autres organes atteints ont pu être identifiées par une méthode de double marquage . Il s'agit majoritairement de cellules phagocytaires mononucléaires telles que les macrophages des tissus hépatiques, pulmonaires ou spléniques mais aussi des monocytes circulants et des cellules de Küpffer. L'implication d'un mécanisme de nécrose cellulaire conduisant à la destruction tissulaire du foie lors de l'infection virale a été longtemps admise . En fait, RHDV induit la mort des cellules par apoptose. Plus précisément, l'apoptose est détectée au niveau des hépatocytes infectés 40h pi . Par ailleurs, il est admis que les cellules apoptotiques sont le siège d'une augmentation de l'activité pro coagulante , ce qui pourrait expliquer l'observation du syndrome de coagulation intravasculaire disséminée associé à l'infection par le RHDV.

2.2.2. Transmission

La maladie hémorragique du lapin peut détruire un élevage de lapins en quelques jours. Cette capacité vient du fait qu'il s'agit d'une maladie hautement contagieuse de transmission horizontale par contact direct ou indirect et par diverses voies . Plusieurs auteurs suggèrent la possibilité de l'intervention de vecteurs biologiques dans la transmission horizontale de la maladie tels que les mouches, les moustiques ou les puces . Par ailleurs, il a été détecté chez le renard sauvage la présence dans le sérum d'Ac anti-RHDV et l'injection parentérale du RHDV chez le chien domestique a entraîné l'excrétion dans les fèces de virus infectieux . De plus, cette maladie étant hautement mortelle, il s'est posé la question de la possibilité du passage du RHDV aux autres espèces animales. Lors des études menées chez le renard et le chien aucun signe clinique lié au RHDV n'a pu être relevé. De même, le lapin infecté par le EBHSV et, réciproquement, le lièvre infecté par le RHDV ne montrent aucun signe clinique. Dans les 2 cas, aucune protection croisée n'est observée . Par ailleurs, il a été suggéré la possibilité de la transmission du RHDV à l'homme . Mais une étude, menée auprès d'une population australienne exposée au RHDV, n'a montré aucune réponse Ac anti-RHDV dans les sérums et aucune incidence sur la santé de cette population .

       

2.2.3. Variabilité génétique/pathogénicité

Deux études épidémiologiques basées sur l'analyse de séquences nucléotidiques du gène de la capside ont été réalisées . Ces 2 analyses portent sur des isolats du RHDV provenant d'épizooties survenues entre 1987 et 1995. Elles révèlent la répartition des différents isolats en 3 génogroupes avec une homologie de séquence allant de 92 à 100%. La divergence entre les séquences analysées est due à une majorité de substitutions silencieuses. En terme de séquences en acides aminés, ces isolats montrent plus de 98% d'homologie. Cependant, depuis 1996, on a pu constater l'apparition de nouvelles souches RHDV présentant une variabilité génétique et pathogénique plus importante . En effet, 4 isolats (2 italiens et 2 allemands), dont 2 sont issus d'épidémies dans des élevages de lapins vaccinés, sont les représentants de nouveaux variants antigéniques du RHDV. Ces isolats montrent 98% d'homologie entre eux au niveau de la séquence peptidique de la protéine de capside mais seulement 95% d'homologie avec les isolats antérieurs à 1996 . Enfin, un 3ème calicivirus nommé RCV (Rabbit CaliciVirus) a été isolé chez le lapin. Il s'agit d'un calicivirus qui montre 91,5% d'homologie avec les souches RHDV antérieures à 1996 mais qui est non pathogène et présente un tropisme essentiellement intestinal chez le lapin. Un challenge par ce virus confère au lapin une protection efficace contre le RHDV .

2.2.4. Vaccination

Dès l'apparition de la maladie en Europe, des recherches intensives visant l'obtention d'un vaccin ont été menées . Ces recherches ont abouti au développement d'un vaccin commercialisé. Le vaccin est préparé à partir de broyats de foies de lapins expérimentalement infectés inactivés par du b -propiolactone pendant 24h à 37C et adjuvés par de l'hydroxyde d'alumine. Ce vaccin permet une protection effective en 3 à 7 jours et son efficacité semble persister pendant 6 à 15 mois. Depuis, la mise en place d'une vaccination systématique a permis un contrôle de la maladie en Europe dans les élevages industriels malgré les quelques rares cas d'échappement décrits précédemment. Actuellement, un vaccin, basé sur la production de pseudoparticules du virus RHDV en système baculovirus/cellules d'insecte, serait en développement.

2.3. Le cycle viral

    2.3.1. Le virion

Les virions purifiés à partir de foie de lapin infecté par le RHDV ont un diamètre de 35 nm et ils présentent à leur surface des dépressions en forme de calice . L'analyse en cryomicroscopie électronique et le traitement d'image par ordinateur des pseudoparticules du RHDV a montré la remarquable similarité entre les structures du RHDV et du NV. En effet, les pseudoparticules du RHDV sont des icosaèdres de symétrie T=3 formés de 180 molécules de la protéine majeure de capside organisées en 90 dimères. La structure de l'icosaèdre montre des protubérances sur les axes 2 et des dépressions sur les axes 5 et 3 .

2.3.2. Le récepteur cellulaire

Peu d'études ont été menées sur le récepteur du RHDV. En fait, une seule approche indirecte fondée sur la capacité du RHDV à agglutiner les érythrocytes humains a été réalisée . Dans cette approche, les auteurs ont montré que les érythrocytes d'origine humaine sont agglutinés par le virus RHDV quel que soit le groupe A, B ou O et l'agglutination n'est pas modifiée par leur traitement aux protéases ou glycosidases. Aucune agglutination n'est obtenue avec des érythrocytes d'origine ombilicale ou ftale et la capacité d'agglutination est inhibée par des extraits de lipides hautement glycosylés. Ces résultats semblent indiquer que le récepteur au RHDV, présent sur les cellules matures, serait de nature glycolipidique.

2.3.3. Réplication virale

Les connaissances sur la réplication du génome viral sont limitées du fait de l'absence d'un système de culture cellulaire efficace pour la réplication du virus RHDV. Cependant, il a été développé un test de fonctionnalité pour vérifier l'activité de l'ARN polymérase ARN dépendante . La région codant pour l'ARN polymérase ARN dépendante du RHDV située entre les nucléotides 3763 et 5310 exprimée dans un système bactérien a permis la purification de l'enzyme de 58 kDa. Cette ARN polymérase purifiée montre une activité poly (U) polymérase poly (A) dépendante résistante à la rifampicine et à l'actinomycine D. Cette enzyme montre aussi une activité ARN polymérase in vitro en présence d'un ARN subgénomique synthétique avec ou sans une amorce poly (U). Cependant, en présence de l'amorce, il a été obtenu un ARN de même taille et de polarité négative alors qu'en absence d'amorce, il a été obtenu un ARN double brin dont les brins étaient liés covalemment à une de leur extrémité. Comme ce dernier résultat prévaut quelle que soit la nature de l'extrémité 3' de l'ARN matrice, il semble que ce phénomène soit dû à une aptitude intrinsèque à la polymérase.

2.3.4. Structure et organisation génomique

Figure 4 : Représentation schématique des ARN génomique et subgénomique du RHDV. La taille du génome en nucléotides est indiquée en haut du schéma.

Les virions du RHDV isolés de foies de lapins contaminés puis purifiés contiennent un ARN génomique de 7437 nucléotides et un ARN subgénomique de 2142 nucléotides. L'ARN génomique contient 2 ORF (l'ORF1 et l'ORF2) et l'ARN subgénomique recouvre la fin de l'ARN génomique à partir du nucléotide 5296 et contient, ainsi, la fin de l'ORF1 codant pour la protéine de capside et l'ORF2 (Fig. 4). L'ORF1 s'étend du nucléotide 10 au nucléotide 7044 et l'ORF2 du nucléotide 7025 au nucléotide 7378 . Les 2 ARN génomique et subgénomique sont liés covalemment à une VPg de 15kDa par leur extrémité 5'. Deux régions non codantes sont conservées aux extrémités 5' et 3' des 2 ARN. Les longueurs de ces régions non codantes sont respectivement de 9 et 59 nucléotides . L'ORF1 code pour une polyprotéine de 257 kDa au sein de laquelle il a été identifié des protéines non structurales, une hélicase, la protéase 3C-like et l'ARN polymérase ARN dépendante, et des protéines structurales, la VPg et la protéine de capside (VP60). Cette polyprotéine porte 3 autres protéines dont les fonctions n'ont pas encore été identifiées.

    2.3.5. Synthèse protéique et maturation

La polyprotéine :

Figure 5 : Maturation de la polyprotéine du RHDV. En haut, représentation de la polyprotéine. En dessous, schématisation des évènements de maturation décrits par König et al. (1998). Les sites de coupures identifiés et la masse moléculaire des produits de maturation sont indiqués sur le schéma.

Etant donné la difficulté de multiplier le virus RHDV en culture cellulaire, la plupart des études menées sur la maturation de la polyprotéine ont été réalisées en systèmes bactériens ou eucaryotes acellulaires. La maturation de la polyprotéine semble se dérouler selon un processus auto-catalytique impliquant la protéase 3C-like . Il s'agit d'une protéase trypsine-like à cystéine dont la triade catalytique est définie par l'His-1135, l'Asp-1152 et la Cys-1212, la cystéine représentant le site nucléophile. En effet, sa substitution par une sérine qui définit le site nucléophile des protéases trypsine-like n'abolit pas l'activité enzymatique. Différentes études, menées en système bactérien et/ou eucaryote acellulaire, ont permis de définir 4 sites de clivage spécifiques de la protéase 3C-like : E-G (718-719), E-G (1108-1109), E-T (1251-1252) et E-G (1767-1768) . Il est important de noter que le clivage par la protéase 3C-like du site ET n'a pu être démontré dans un système eucaryote acellulaire .

Par ailleurs, pour étudier la spécificité de clivage de la protéase 3C-like, une mutagenèse dirigée aux positions P2, P1 et P1' du site E-G (1108-1109) a été menée . Cette analyse a montré que l'acide aminé situé en position P1 est le plus important pour le processus de clivage. Seuls les acides aminés ; acide glutamique (E), glutamine (Q) et acide aspartique (D) sont tolérés. A la position P1', de nombreux acides aminés sont tolérés mais avec une préférence marquée pour les acides aminés ; glycine (G), sérine (S), alanine (A). Pour la position P2, l'analyse indique une préférence pour les acides aminés hydrophobes ou avec un encombrement stérique important tels qu'une tyrosine (Y), une phénylalanine (F) ou une leucine (L). Plus récemment, pour vérifier les résultats obtenus in vitro, l'expression des protéines du virus RHDV dans les hépatocytes primaires de lapin a été analysée par marquage métabolique et immunoprécipitation . Cette analyse a conduit à l'établissement d'une carte de la polyprotéine du RHDV (fig. 5). Le processus de maturation de la polyprotéine comprend au moins 2 étapes. Une 1ère étape permet la libération de la protéine p16, de la protéine de capside et de 3 intermédiaires de maturation (p65, p41 et p72). A cette étape, les sites E-G (718-719) et E-G (1108-1109) permettent la libération du précurseur p41, les sites E-G (1767-1768) et EG (1767-1768) la libération du précurseur p72. La deuxième étape conduit à libération de 6 protéines supplémentaires. Les auteurs ont proposé que le site ET (1251-1252), qui a été décrit dans un système d'étude bactérien comme faiblement clivé, pourrait correspondre au site permettant le passage du précurseur p72 à la libération de la protéase 3C-like et de l'ARN polymérase. En conclusion, la maturation de la polyprotéine mène à la libération d'au moins 8 protéines qui implique donc 7 sites de clivage. Actuellement, 3 sites de coupure restent encore non identifiés.

La protéine de capside :

La protéine de capside du RHDV a une taille de 62 kDa. La résolution de la structure tridimensionnelle du RHDV a permis de montrer que les particules virales étaient constituées d'un assemblage de 90 dimères . Le travail de thèse de Sylvie Laurent a montré que les protéines de capside forment des dimères maintenus par un pont disulfure établi à partir de l'unique cystéine (cys-291). De plus, le fait que la mutation de cette cystéine en arginine entraîne la perte de la capacité d'auto-assemblage de la capside du RHDV suggère que les particules virales s'assemblent à partir de dimères préformés.

Par ailleurs, les analyses réalisées à l'aide de sérums polyclonaux anti-RHDV ont montré que la protéine de capside était la cible majeure de la réponse humorale protectrice . De plus, la protéine de capside exprimée en système baculovirus/cellules d'insectes (sf9) permet d'obtenir une grande quantité de pseudoparticules virales vides de tout acide nucléique et ayant les mêmes caractéristiques morphologiques et immunologiques que les virions infectieux . Ces résultats ont suggéré le développement de vaccins recombinants anti-RHDV qui permettraient une alternative aux vaccins actuels qui requièrent l'utilisation d'animaux pour leur production. Un premier vaccin élaboré à partir de pseudoparticules virales inertes s'est révélé aussi efficace que les vaccins commercialisés . Un deuxième vaccin, constitué d'une souche virale de la myxomatose non virulente dans laquelle le gène de la capside du RHDV a été introduit, administré par voie intradermique au lapin, protège à la fois contre la myxomatose et le RHDV . Récemment, il a été produit des plantes transgéniques exprimant la protéine de capside du RHDV dans le but de vacciner les lapins sauvages et fermiers par l'intermédiaire de la nourriture . Bien que l'injection sous cutanée d'extraits de ces plantes induise chez le lapin une protection efficace contre RHDV, il semble que le niveau d'expression de la protéine de capside dans les plantes transgéniques soit insuffisant pour une vaccination par voie orale.

VP10 :

La VP10 est codée par l'ORF2 chez le RHDV. Il s'agit d'une petite protéine structurale de 10 kDa qui est présente en très faible quantité dans les particules virales . De plus, le caractère basique de cette protéine suggère un rôle dans l'encapsidation du génome par une interaction avec la protéine de capside et l'ARN viral. Par ailleurs, des recherches développées au laboratoire par Denis Rasschaert ont montré que la VP10 est produite par un nouveau mécanisme de couplage traductionnel. Selon ce mécanisme, 20% des ribosomes arrivant au codon stop de l'ORF1 ne se détacheraient pas et remonteraient jusqu'à l'ATG de l'ORF2 pour initier la traduction de la VP10.

 

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Réalisation : 5 octobre 2000
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