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Thèse Pascale Joubert
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Sommaire
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SOMMAIRE
1. La famille des Caliciviridae
1.1. Taxonomie
1.1.1. L’historique de la famille
1.1.2. Phylogénie et classification
1.1.3. Le cas particulier du virus de l'hépatite E (HEV)
1.2. Virion et composants
1.3. Structure et organisation génomique
1.4. Le cycle viral
1.4.1. Les phases précoces de l'infection
1.4.2. Réplication du génome
1.4.3. Synthèse protéique et maturation
2.1. Histoire
2.2. Pathologie
2.2.1. Tableau clinique/cytopathologie
2.2.2. Transmission
2.2.3. Variabilité génétique/pathogénicité
2.2.4. Vaccination
2.3. Le cycle viral
2.3.1. Le virion
2.3.2. Le récepteur cellulaire
2.3.3. Réplication virale
2.3.4. Structure et organisation génomique
2.3.5. Synthèse protéique et maturation
3.1. Introduction
3.2. Les différents types de protéase
3.4. Maturation de la polyprotéine des Picornaviridae
3.5. Maturation de la polyprotéine des Flaviviridae
4. Contexte et objectif du travail
1. Souches bactériennes, souche virale et lignées cellulaires
1.1. Souches bactériennes d'Escherichia coli
1.2. Cellules de rein de lapin RK13
1.3. Lignée cellulaire LMH
1.4. Virus de la vaccine T7 (vTF7-3)
2. Anticorps monoclonaux et sérum polyclonal
2.1. Anticorps monoclonal 3b5
2.2. Sérum polyclonal anti-3D
2.2.1. Préparation de l'antigène
2.2.2. Immunisation du lapin
2.3. Anticorps anti-VP60
3. Plasmides
4. Séquences
4.1. Séquence peptidique de la polyprotéine du RHDV
4.2. Séquences des différents oligonucléotides
4.3. Séquence de la construction pBPL10
5. Techniques générales de biologie moléculaire
5.1. Amplification PCR
5.2. Purification des inserts
5.3. Hybridation des oligonucléotides
5.4. Préparation du vecteur
5.5. Ligation
5.6. Electroporation
5.7. Minipréparations
5.8. Maxipréparations
6. Elaboration des différentes constructions
6.1. Elaboration des constructions pBPL
6.1.1. La construction pBPL10
6.1.2. Elaboration des constructions pBPL
6.1.3. Elaboration des constructions pEG-3CY
6.2. Elaboration des constructions pQ
6.3. Elaboration des constructions portant les gènes d'intérêt
6.4. Mutagenèse aléatoire du dipeptide EG2
7. Préparation des extraits cellulaires
8. Systemes d'expression
8.1. Système TNT7/lysat de réticulocytes
8.2. Système vaccine T7/cellules de rein de lapin
9. Techniques d'analyse des produits d'expression
9.1. Gel de séparation SDS-PAGE
9.2. La technique du western-blot
9.3. Immunoprécipitation
10. Mesure de l'activité luciférase (Nguyen et al., 1988)
1. Validation de la technique
2. Identification deS sites de maturation
2.1. Recherche de nouveaux sites de maturation après clivage en cis par la protéase 3CL
2.2. Efficacité de coupure en cis de la protéase 3CY
2.3. Délimitation de l'activité de la protéase 3C-like
2.4. Localisation de nouveaux sites de clivage par activité trans de la protéase
2.5. Effet de la complémentation sur l'efficacité de clivage
2.6. Mutagenèse aléatoire sur le dipeptide EG2 (143-144)
3. Maturation de la polyprotéine du RHDV
3.1. Etude cinétique de la maturation de la polyprotéine
3.2. Identification des intermédiaires de maturation comportant VP60 et 3D
3.3. Etude de la maturation de la polyprotéine en présence de la protéase 3CY ou 3CD
4. Recherche de cofacteurs impliqués dans la maturation de la polyprotéine
4.1. Les cofacteurs d'origine virale
4.2. Les cofacteurs d'origine cellulaire
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Réalisation : 19
octobre 2000
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